靶向SALL4脱氧核酶抑制肝细胞癌恶性表型的实验研究

目的通过探讨靶向SALL4的脱氧核酶对人肝癌细胞Hep G2的增殖、侵袭、迁移以及肿瘤成球等恶性表型的影响,为应用脱氧核酶抑制肝癌提供理论依据。方法设计靶向SALL4的脱氧核酶,利用lipofectamine 3000将脱氧核酶转染到Hep G2细胞中,采用q PCR和Western blot方法检测SALL4 mRNA和蛋白表达;体外mRNA切割实验验证脱氧核酶对SALL4mRNA的切割效果;利用CCK8、Transwell侵袭/迁移、划痕实验和肿瘤成球实验观察脱氧核酶转染后肝癌细胞增殖、侵袭、迁移和成球能力的变化。结果转染靶向SALL4脱氧核酶Dz-2后,与阴性对照相比,Hep G2细胞中SALL4 mRNA和蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P <0. 01),体外mRNA切割实验证实脱氧核酶对SALL4 mRNA具有靶向切割能力;同时发现,转染脱氧核酶Dz-2的实验组与阴性对照组相比,细胞增殖、侵袭、迁移和成球能力均明显降低,差异具有统计学意义(P <0. 01)。结论靶向SALL4的脱氧核酶能够靶向切割SALL4 mRNA并抑制人肝癌细胞Hep G2的SALL4表达,并且有效抑制细胞增殖、侵袭、迁移和成球等恶性表型。

NEDD8抑制剂MLN4924抑制肝细胞癌恶性表型的研究

目的研究NEDD8抑制剂MLN4924对肝细胞癌增殖、迁移侵袭等恶性表型的影响及其分子机制。方法以人肝癌细胞株Hep3B为研究对象,将细胞分为3组,分别为MLN4924组(使用NEDD8抑制剂MLN4924处理)、阴性对照组(等体积DMSO处理)和空白对照组(不作任何处理)。Western blot方法检测NEDD8蛋白及其介导的neddylation的水平及E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达。CCK-8实验检测细胞增殖。Transwell实验和划痕实验检测细胞迁移侵袭能力。结果与阴性对照组相比,MLN4924组NEDD8蛋白表达量增加,而NEDD8介导的neddylation减少,并且细胞的增殖、迁移侵袭能力均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与阴性对照组或空白对照组相比,MLN4924组细胞伪足消失,缩小变圆,呈上皮细胞形态,同时E-cadherin蛋白表达明显升高,N-cadherin蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论MLN4924通过抑制NEDD8介导的neddylation从而抑制肝癌细胞增殖、迁移侵袭等恶性表型,同时抑制EMT发生。

成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9敲除Ku80基因提高HEK293T细胞对阿霉素的敏感性

目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术将293T细胞中的Ku80基因敲除，建立Ku80敲除的293T细胞株，并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先，设计识别针对靶位点的1对DNA Oligos，利用pSpCas9（BB）-2A-Puro （PX459）质粒构建表达导向RNA（sgRNA）载体。载体转染293T细胞。通过定点聚合酶链式反应（PCR）和T7E1内切酶酶切鉴定，确认所设计的sgRNA的有效性。进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选，挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株。最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变。使用阿霉素处理诱导DNA损伤，以磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）为指标检测DNA损伤，同时用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性。结果成功构建Ku80基因敲除的293T细胞，用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后，对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为（30.67±2.49）%和（88.00±1.63）%（P=0.000），表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制。同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性，阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为（53.99±1.29）%和（32.42±1.20）%（P=0.000）。结论293T细胞中敲除Ku80抑制了DNA损伤的修复和提高了细胞对阿霉素的敏感性。