重组人神经生长因子通过抑制小胶质细胞炎症反应发挥神经保护作用

目的探讨重组人神经生长因子(rhNGF)的神经保护作用及其机制。方法BV2小胶质细胞分为细胞对照组、脂多糖(LPS)组及LPS+rhNGF 50和500μg·L^(-1)组。除细胞对照组外,其余3组用LPS 1 mg·L^(-1)刺激BV2细胞24 h诱导BV2细胞炎症反应,随后LPS+rhNGF组加rhNGF继续孵育48 h。孵育结束后收集BV2细胞,并收集各组培养上清即条件培养基(MCM),各组BV2细胞和MCM分别与小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a(N2a)共培养12或24 h。CCK-8法检测BV2细胞存活率,实时荧光定量PCR检测BV2细胞中促炎因子白细胞介素(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-1β及抗炎因子IL-4和IL-10 mRNA表达水平,CBA法检测BV2细胞培养上清中IL-6,TNF-α,IL-4和IL-10浓度,免疫荧光法检测BV2细胞M1表型标志物CD16和M2表型标志物CD206表达,NeuN/TUNEL共染法和AnnexinⅤ/7-AAD法检测N2a细胞凋亡率。结果与细胞对照组相比,LPS组BV2细胞存活率显著下降(P<0.01),细胞变圆且胞体变大;促炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α及抗炎因子IL-10 mRNA水平显著升高(P<0.01),抗炎因子IL-4 mRNA水平下降(P<0.01);IL-6和TNF-α蛋白水平显著升高(P<0.01),IL-4蛋白水平无显著差异;CD16和CD206阳性细胞百分比明显升高(P<0.01),CD16阳性细胞升高更加明显;与BV2细胞或其MCM共培养的N2a细胞存活率显著降低且凋亡率显著升高(P<0.05,P<0.01)。与LPS组相比,LPS+rhNGF 50和500μg·L^(-1)组BV2细胞存活率显著提高(P<0.01);IL-1β,IL-6和TNF-αmRNA水平显著降低(P<0.05),IL-4和IL-10 mRNA水平显著提高(P<0.05,P<0.01);IL-6和TNF-α蛋白水平显著降低(P<0.05,P<0.01),IL-4蛋白水平无显著差异,IL-10浓度低于检测限;CD206阳性细胞百分比显著升高(P<0.01),CD16阳性细胞百分比显著降低(P<0.05)。与LPS处理的BV2细胞或MCM-LPS组相比,与rhNGF 50和500μg·L^(-1)处理的BV2细胞共培养组及与MCM-rhNGF 50和500μg·L^(-1)共培养组N2a细胞存活率显著升高且凋亡率显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论rhNGF可通过抑制BV2细胞炎症反应诱导BV2细胞向M2表型转化,抑制N2a细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。

4-羟基他莫昔芬依赖的内含肽调控绿色荧光蛋白功能研究

目的:验证小分子4-羟基他莫昔芬(4-HT)依赖的内含肽调控绿色荧光蛋白(eGFP)功能的可行性。方法:根据eGFP的结构与功能,在蛋白上选取7个氨基酸位点,通过同源重组方式将内含肽序列插入不同位点,转染293T细胞系后通过流式细胞术检测eGFP的表达情况,分析4-HT依赖的内含肽调控剪接效率。结果:在选取的7个氨基酸位点中,有5个具有调控效果,其中S148位点的4-HT调控效果最好,4-HT的最适工作浓度为4μmol/L。结论:在eGFP蛋白上发现一个新的高效的4-HT调控的内含肽剪接位点S148,与已报道位点R109相比,剪接效率提高8倍。

人5型腺病毒结合抗体检测方法的建立和应用

目的:建立人5型腺病毒(HAdv5)结合抗体检测方法,用于检测动物实验中血清的抗HAdv5结合抗体水平。方法:将复制缺陷型HAdv5感染293F细胞,大量表达HAdv5抗原蛋白,经Source 30Q和Sepharose 4FF两步柱层析,获得高纯度的HAdv5抗原蛋白,分别采用SDS-PAGE、HPLC和Western印迹对纯化的抗原进行鉴定,并与市售的HAdv5-Hexon进行对比分析。用纯化的HAdv5抗原蛋白建立HAdv5结合抗体检测方法,分别对包被液、抗原包被量和二抗工作浓度等检测条件进行摸索,对该方法的特异性和稳定性进行验证,并检验该方法检测结果与相应HAdv5中和抗体的相关性。最后将该检测方法应用于HAdv5载体疫苗免疫小鼠血清的HAdv5载体结合抗体水平检测。结果:获得纯度大于95%的HAdv5抗原蛋白,与市售HAdv5-Hexon相对分子质量大小一致,经HPLC和Western印迹鉴定其为HAdv5-Hexon蛋白。用纯化的HAdv5-Hexon作为抗原建立了HAdv5结合抗体检测ELISA法,确定抗原包被浓度为2μg/mL。该检测方法与其他亚型腺病毒如HAdv4、HAdv7具有一定的交叉反应,但对于无关病毒具有良好的特异性;同时该检测方法具有良好的稳定性,板内重复变异系数小于10%,板间和日间重复变异系数小于15%。该检测方法对HAdv5载体疫苗免疫小鼠血清的检测结果与HAdv5中和抗体检测结果具有良好的相关性。应用于HAdv5载体疫苗免疫小鼠血清的HAdv5结合抗体水平检测,充分显示了该法的快速、简便及高灵敏度和准确度的优势。结论:建立了稳定可靠的HAdv5结合抗体检测方法,可用于SPF级动物模型HAdv5载体结合抗体检测。

利用报告基因的人7型腺病毒中和抗体检测方法的建立

目的:构建表达萤光素酶报告基因的重组人7型腺病毒(HAdV7)Ad7-dE1-dE3-Luc(Ad7-Luc)病毒,用于检测人群中HAdV7的中和抗体水平。方法:利用同源重组方法构建E1区和E3区部分缺失,并在E1区嵌入萤光素酶基因表达框的pAd7-Luc重组质粒,转染HEK-293细胞,包装出能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7载体重组病毒(Ad7-Luc);选取HAdV7阳性血清样本对新建立的报告基因检测方法的准确性和稳定性进行验证;最后,利用该方法对北京地区60份血清样本进行HAdV7中和抗体检测。结果:获得能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7-Luc重组病毒,病毒滴度可达4.85×10~8IFU/mL,Ad7-Luc检测法与传统细胞病变效应(CPE)法具有很好的一致性(R^2=0.8612,P<0.0001),批内和批间差异分别在10%和20%以内。北京地区60例血清样本的检测结果显示,HAdV7血清阳性率约为60%(36/60),明显低于HAdV5血清阳性率75%(45/60),75%的HAdV7阳性血清中和抗体滴度集中于低滴度水平(12～200)。结论:与传统的细胞病变方法相比,HAdV7中和抗体报告基因检测方法更快速、灵敏、准确,适用于人群中HAdV7血清流行病学调查及其疫苗的中和抗体研究。