应用型本科猪病学课程教学设计及实践

猪病学是应用型本科动物医学专业的一门重要专业选修课,该课程的主要任务是培养学生解决猪病相关问题的综合能力。基于应用型本科培养人才特点、猪场兽医就业岗位需求以及养猪行业变化等,从教学目标、教学内容、教学方法、教学成绩考核等方面进行了应用型本科猪病学课程教学设计,并在教学中应用,取得较好效果。

IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响

【背景】塞内卡病毒(senecavirus A,SVA)是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区(untranslated region,UTR)中的内部核糖体进入位点(IRES)元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株,在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响,为进一步了解SVA致病机制奠定基础。【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础,通过定点突变的方式,逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基(ACTCAAGCG)替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基(CACGCCTGCCGATAGACGATT),构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后,利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定,同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定,P5代病毒基因组序列未发生碱基突变,P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2,及仓鼠源细胞系BHK-21,进行细胞感染试验,结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变,表现出相似的生长曲线趋势,表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性;但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异,rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差,诱使细胞病变的时间较晚,在感染24 hpi,两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株,确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响,有助于我们更好地了解SVA致病机制,拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。

猪流行性腹泻病毒变异株XP2018的分离及S基因序列分析

本研究旨在从临床仔猪腹泻样品中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),并对其S基因进行测序分析。对腹泻仔猪小肠样品进行RT-PCR检测、病毒的分离培养、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定、S基因测序及遗传演化分析。结果显示:仔猪腹泻由流行性腹泻病毒引起;在Vero细胞上成功分离流行性腹泻病毒,命名为XP2018,该毒株细胞病变明显,并且连续传代细胞病变稳定;该毒株S基因全长为4161 bp,与中国经典毒株CV777 S基因核苷酸同源性为92.6%,氨基酸同源性为91.0%;与近年来中国分离的其他毒株S基因核苷酸同源性为96.9%~97.6%,氨基酸同源性为96.9%~98.0%;与美国参考毒株S基因核苷酸同源性为96.9%~97.6%,氨基酸同源性为96.6%~98.3%;遗传进化分析显示XP2018毒株与与目前中国流行毒株在同一分支,与经典毒株CV777不在一个分支上。本研究成功分离1株猪流行性腹泻病毒流行毒株,为PEDV疫苗研发奠定了基础。

2017-2018年河南省猪流行性腹泻病毒S基因序列分析

为分析河南省猪流行性腹泻病毒S基因的遗传变异情况,本试验于2017年10月—2018年2月从河南省8个规模化猪场采集80份有腹泻症状的仔猪肠道样品,利用RT-PCR方法进行猪流行性腹泻病毒检测,并对部分阳性样品进行S基因全长序列扩增、测序和遗传进化分析。结果显示,8个规模化猪场80份样品中共检测出6个场60份样品为猪流行性腹泻病毒阳性,阳性率为75%;选取的6株猪流行性腹泻代表株间S基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别是98.4%~99.9%和98.2%~100%,与经典毒株CV777之间的同源性分别是93.7%~94.9%和92.4%~94.6%;遗传进化分析显示,6株猪流行性腹泻代表株属于同一群,与CV777处在不同的分群,表明河南省猪流行性腹泻病毒流行毒株与疫苗毒株亲缘关系较远。本试验明确了河南省猪流行性腹泻病毒遗传变异情况,为猪流行性腹泻的诊断和防控提供了依据。

共表达猪流行性腹泻病毒S1与GM-CSF蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1与GM-CSF融合基因的重组腺病毒,通过FMDV的2A基因序列做为Linker将密码子优化的S1基因和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因连接。构建重组穿梭质粒pShuttle-GM-CSF 2A-S1(m),并将其电转化至含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠埃希菌BJ5183感受态细胞中,通过同源重组制备重组腺病毒质粒pAd-GMCSF2A-S1(m)。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒rAd-GMCSF2A-S1。间接免疫荧光和Western blot结果显示,S1和GMCSF蛋白在重组腺病毒感染的HEK-293A细胞中获得表达。该重组腺病毒的制备为PEDV重组活载体疫苗的研究奠定了基础。

案例设计在兽医传染病学实践教学中的应用

兽医传染病学实践教学是将兽医传染病学理论应用于兽医实践的过程,是动物医学专业学生职业素质的体现.畜牧业转型升级对兽医传染病学实践教学提出了新的挑战.为解决这个困境,本文在课程设计、案例调查、角色扮演、小组讨论等方面进行探讨.

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白质对小鼠的免疫保护性

为了研究不同浓度的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白质对接受1010 CFUEHEC O157∶H7小鼠的免疫保护作用,将Intimin和Tir-Tccp蛋白质和佐剂充分乳化后,通过皮下多点注射免疫小鼠,对照组注射等量的磷酸盐缓冲液。共免疫2次,间隔14 d,末次免疫后14 d攻毒1只小鼠EHEC O157∶H7 1010CFU。每次免疫后的14 d通过断尾采血,用间接ELISA法检测血清抗体。攻毒后,观察小鼠精神状态,记录死亡数并检测排菌量。ELISA检测结果表明,Tir-Tccp蛋白质诱导小鼠产生IgG抗体水平明显升高,而Intimin诱导产生的IgG抗体升高不明显。攻毒后,各免疫组小鼠均死亡1只,存活14只,存活率为93.3%;对照组小鼠死亡4只,存活6只,存活率为60.0%。免疫组在攻毒后6 d,粪便中检测不到EHEC O157∶H7,对照组在攻毒后13 d仍有较高的排菌量。表明Intimin和Tir-Tccp蛋白质对小鼠起到了有效的免疫保护作用,能够减少EHEC O157∶H7在小鼠体内的定殖。

猪源绿脓杆菌的分离鉴定及16S rRNA基因同源性分析

从解剖病变为心包炎、纤维素性肺炎、肺脓肿的病死仔猪体内分离到1株细菌,通过形态特征观察、生化试验,将分离菌株初步鉴定为绿脓杆菌。动物致病性试验结果显示,分离菌株对小鼠具有很强的致病性。药敏试验结果显示,分离菌株对氧氟沙星、恩诺沙星高度敏感,对头孢噻肟、庆大霉素中度敏感,对青霉素、氟苯尼考、氨苄西林、阿莫西林、强力霉素、卡那霉素等耐药。将分离菌株的16S rRNA基因序列与Gen Bank中发表的绿脓杆菌序列进行Blast比对,结果表明,分离菌株与绿脓杆菌不同菌株的同源性高达99%以上,进一步确定分离菌株为绿脓杆菌。基于16S rRNA基因序列,使用MEGA 5.05软件,构建系统进化树,结果表明,分离菌株与病人痰液和腹泻婴儿分离菌株的同源性最高,与未加工水果分离菌株同源性最低。

出血性大肠杆菌O157：H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA。二免后攻击50LD50的EHECO157∶H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短。结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。

EHEC O157：H7二重PCR的建立及应用

建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是食源感染的人兽共患病原菌。鞭毛蛋白(H7)是EHEC O157∶H7重要的毒力因子,其编码基因为flic。该研究在体外克隆和表达flic基因的可变区,并检测其免疫原性,旨在为EHEC O157∶H7疫苗的研制提供候选抗原。PCR扩增到flic基因538～1 483bp的可变区,成功克隆入冷诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒。重组菌BL21(pCold I-flic)0.5 mmol/LIPTG过夜诱导,SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。Balb/c小鼠免疫和攻毒试验评价重组H7蛋白的免疫原性。结果显示:H7基因(flic)片段945 bp在pColdⅠ中成功表达,大小为31 000,能够与天然EHEC O157∶H7全抗血清反应;免疫小鼠存活率可以达到80%,而非免疫小鼠存活率仅为20%;免疫组粪便排菌数量显著低于对照组(P<0.05)。以上结果说明,H7鞭毛的可变区与菌体黏附密切相关,并且其诱导产生的抗体具有一定的抑制黏附作用,可以作为亚单位疫苗研制的候选抗原,在EHEC O157∶H7早期黏附时,协同Ⅲ型分泌系统蛋白降低菌体在肠道内的黏附。

2018年河南省奶牛布鲁氏菌病感染情况调查

奶牛布鲁氏菌病(以下简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病,可引起母畜流产和乳房炎,公畜睾丸炎、附睾炎或关节炎[1]。奶牛布病不仅影响奶牛的生产性能,给奶牛养殖业造成严重的经济损失,人感染后影响患者生殖健康和生活质量,严重者丧失劳动能力,还可影响家畜及其产品的贸易[2-3]。因此,奶牛布病的监测和净化至关重要。为了解河南省奶牛布病感染现状,对河南省未免疫奶牛场群进行了布病抗体检测,采用虎红平板凝集试验初筛,阳性样品进行试管凝集试验复核,并按区域和场点类别对检测结果进行了统计分析。

河南省规模奶牛场结核病感染情况调查

为了解河南省奶牛结核病感染情况,2018年以全省规模奶牛场为研究对象,采用估计流行率的抽样策略,开展奶牛结核病检测,并对检测结果进行空间和群间分布分析。全年共对152个监测场点的12417头活牛进行牛型结核菌素皮内变态反应试验。结果显示:全省规模奶牛场结核病场群阳性率为8.55%,个体阳性率为1.36%;豫西地区奶牛结核病个体阳性率最高,达8.91%,豫南地区无阳性活牛检出,其他地区个体阳性率介于0.05%~0.21%之间;存栏量≤100头的规模奶牛场个体阳性率最高,存栏量>2000头的规模奶牛场无阳性检出。结果表明,河南省规模奶牛场存在一定程度的牛结核病感染,豫西地区奶牛场和小规模奶牛场流行情况尤为严重,因此需针对不同区域和不同规模场群,制定相应的防控、净化措施。本研究掌握了河南省奶牛结核病的流行情况和分布特点,对于河南省奶牛结核病净化以及保障公共卫生安全具有重要意义。

2017—2019年河南省病死猪常见病原分布

为了解河南省病死猪群常见病原分布规律,2017—2019年共对1729份病死猪组织样品进行了猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)和副猪嗜血杆菌(HPS)病原学检测。结果显示:PCV2和HPS检出率较高,分别为73.68%和57.26%,其他6种病原检出率为0.75%~13.24%,混合感染率为60.15%;2018年检出病原种类最多,且病原检出率较高;春季检出病原种类最多,冬季较少;豫西、豫中地区检出病原种类较多,豫南地区较少。结果表明,河南省猪群中病原分布范围广、检出率高、混合感染严重,且具有一定的时间和空间分布特征。结果提示,河南省猪群疫病防控形势较严峻,各猪场应依据不同病原流行特点制定相应的防控措施。

肠出血性大肠杆菌O157:H7△hly△stx△toxB基因缺失株的构建

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157:H7是食源感染的人兽共患病原菌。志贺毒素(Shiga toxin,Stx)、溶血素(haemolysin,Hly)和ToxB是O157:H7重要的毒力因子。选用自杀性质粒pMEG375,体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,借助于sm10宿主菌获得O157:H7杂交菌株,通过同源重组,依次获得O157:H7(△hly△stx△toxB)基因缺失株,△hly△stx△toxB接种HEp-2细胞和感染链霉素处理的Balb/c小鼠,明确缺失株粘附定植的能力。经PCR鉴定,hly、stx和toxB基因分别被壮观霉素(Spc+)、庆大霉素(Gm+)和卡那霉素(Kan+)基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,O157:H7(△hly△stx△toxB)检测不到相应的Stx、Hly和ToxB蛋白。O157:H7(△hly△stx△toxB)生长特性与亲本株无明显差异。对于HEp-2细胞的粘附能力明显降低。Balb/c小鼠排菌时间和排菌量明显减少和降低。本研究成功获得O157:H7(△hly△stx△toxB),并且明确Stx、Hly和ToxB的缺失导致了O157:H7对HEp-2细胞和Balb/c小鼠的粘附和定植能力降低。本研究旨在为研制EHEC O157:H7基因缺失疫苗奠定物质基础。

2018年河南省屠宰猪群常见病原携带情况调查

为了解河南省猪群中常见猪病病原隐性感染情况,2018年以屠宰场猪群为研究对象,每个季度采用横断面研究方法,开展常见猪病病原携带情况调查。采集猪扁桃体、淋巴结组织样品,对同一头猪的不同组织进行混样处理,进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)以及副猪嗜血杆菌(HPS)和弓形虫(TP)的病原学检测,并对结果进行时间和空间分布分析。本调查在全省5个区域,共检测样品972份,除未检出CSFV和FMDV外,其他9种病原均有检出,检出率在0.21%～64.81%之间;PPV、PCV2、PCV3、HPS等4种病原一年四季均有检出,且地域分布较广,检出率较高,需重点加强防控;PRRSV、PRV、TEGV、PEDV、TP等5种病原呈现一定季节性和区域性分布特征,需针对不同季节和不同区域,制定相应防控措施。

西藏拉萨市林周县虎头山水库春季藻类群落特征及其水体理化因子相关性分析

为研究西藏拉萨市林周县虎头山水库春季藻类群落结构特征与水体环境因子间的关系,于2015年5月在虎头山水库设置了六个采样点,用活体观察法鉴定藻类物种,并用直接计数法统计藻类的数量。共鉴定出183种藻类,隶属于8门10纲22目30科51属,其中双壳缝目49种,占26.78%,为优势类群;无壳缝目25种,占13.66%,为次优势类群;气球藻目1种,占0.55%,为罕见类群,其余为常见类群。优势种有简单舟形藻(Navicula simplex)、针状蓝纤维藻(Dactylococcopsis acicularis)、尖针杆藻(Synedra acus)、放射舟形藻(Navicula radiosa)、小球藻(Chlorella vulgaris)、颤丝藻(Ulotrix osillarina)。结果表明,该水库藻类物种丰富,群落结构复杂,各采样点的藻类,相似度低,具有局部地域性和小环境的特征。藻类群落结构参数与水体理化因子间的相关性表明,水体理化因子与藻类群落组成无相关性。

2019年河南省猪伪狂犬病病原学监测分析

为掌握2019年河南省猪群伪狂犬病流行情况,对来自河南省268个监测场点的7158份猪组织样品进行了猪伪狂犬病病原学检测,并对检测结果进行了时间、空间和群间分布分析。检测结果显示:2019年河南省猪伪狂犬病病原个体检出率和场群检出率分别为1.33%和6.72%;不同季节猪伪狂犬病病原检出率介于0.61%~7.13%之间,春季检出率最高;河南省18个地市中,有7个地市存在猪伪狂犬病病原学阳性样品检出,检出率介于0.21%~12.90%之间;不同类别场点中,种猪场无病原学阳性样品检出,商品代猪场、屠宰场和无害化处理厂检出率依次升高,介于0.34%~3.24%之间。调查结果表明,河南省猪伪狂犬病病原具有一定的时间、空间和群间分布特征,应依据其分布特点和规律制订或调整防控和净化措施。

应用型本科《兽医传染病学》课程教学设计与实践

河南牧业经济学院于2012年由专科升格为本科院校,在发展规划中定位为应用型大学。应用型大学培养的人才既不同于综合性研究型大学所培养的理论性人才,也不同于职业性技能型院校所培养的实用性技能人才,其不仅能掌握现代社会生产、建设与服务一线从事管理和直接操作的各种高级技能,还具有设计与开发能力。兽医传染病学属于动物医学专业的主干核心课程之一,在专业课程体系中处于核心地位。

应用型本科兽医传染病学实验实训课程教学设计

应用型本科兽医传染病学实验实训课程是兽医传染病学课程教学的重要组成部分,是动物医学专业的主要实践环节之一。该文就应用型本科兽医传染病学实验实训课程教学设计的理念与依据、内容选取、组织与实施、考核进行研究与探索,并在2013级、2014级、2015级动物医学本科生中应用,取得较好的效果。