磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶的克隆及在大肠埃希菌中的表达

目的在大肠埃希菌中表达磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(phospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidase,PHGPx),以期用于抗PHGPx抗体的制备。方法用特异引物从基因文库中扩增出PHGPxcDNA,与表达载体重组,转化大肠埃希菌。重组体中的PHGPx经点突变作用,编码硒半胱氨酸的密码子UGA变为编码半胱氨酸的UGU。结果序列分析表明,克隆载体中包含PHGPx的完整编码序列及3'未翻译区序列;经SDS鄄PAGE及WesternBlot证实PHGPx在大肠埃希菌中获得了成功表达。结论突变的PGPGx可以在大肠埃希菌中高效表达并可用于制备抗PHGPx抗体。

人类磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶的真核表达及其多克隆抗体的制备

目的在真核细胞中表达人磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)并制备抗PHGPx多克隆抗体。方法用特异引物从人睾丸组织cDNA文库中扩增出人线粒体型PHGPxcDNA,与真核表达载体pcDNA3.1/His重组,在COS-1细胞内表达PHGPx。用大肠杆菌表达的突变的PHGPx免疫动物,制备抗PHGPx抗体。结果重组体pcDNA-PHGPx转染的COS-1细胞表达了人PHGPx融合蛋白,PHGPx活性为111.5μmol·mg-1·min-1,高于对照组5倍。免疫扩散测得抗PHGPx多克隆抗血清滴度为1∶16;用于蛋白印迹时稀释倍数为1∶500,可见特异免疫沉淀条带。结论人PHGPx在COS-1细胞内获得了表达,抗PHGPx多克隆抗体有特异性,可以用于重组表达的PHGPx的鉴定。

痘苗病毒增强人类白血病细胞免疫原性的实验研究

作者应用痘苗病毒处理人白血病细胞制备瘤苗,免疫正常615系小鼠。结果发现,实验组小鼠的NK细胞活性、白细胞介素-2(IL-2)诱生水平显著提高,T辅助细胞数及T_(11)/Ts比值显著提高(与对照组相比,P<0.01或P<0.05),未经痘苗病毒处理的人白血病细胞则无此作用。

表达红色荧光蛋白重组柯萨奇病毒B组3型基因组稳定性分析

本文旨在分析含红色荧光蛋白mCherry基因的重组柯萨奇病毒B组3型(CVB3)基因组的稳定性。用重组质粒pCVB3-mCherry转染HeLa细胞,观察细胞病变和mCherry的表达。收获病毒后,用噬斑形成实验纯化病毒并测定病毒毒力。将重组病毒CVB3-mCherry在HeLa细胞中连续传代,提取第2～6代重组病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出报告基因mCherry及CVB3部分序列,进行测序分析。结果表明,pCVB3-mCherry转染的HeLa细胞出现细胞病变并表达红色荧光蛋白mCherry;从第2代开始,CVB3-mCherry出现报告基因mCherry及部分CVBVP4基因序列丢失,基因序列丢失导致病毒开放读码框架移位。本研究表明,mCherry基因序列的插入导致CVB3基因组不稳定。随着病毒的传代逐渐丢失插入的报告基因mCherry及CVB3基因组的部分序列,病毒读码框架移位,产生致死性突变株。因此,应用CVB3-mCherry时,病毒的传代次数不超过2代,否则应重新从重组质粒中收获病毒,并对每代重组病毒进行纯化和毒力测定。

痘苗病毒增强人类白血病细胞特异性抗原的实验研究

我们应用痘苗病毒处理人白血病细胞制备瘤苗,免疫豚鼠,取其腹腔渗出细胞进行巨噬细胞移动抑制实验。以瘤苗为刺激抗原时,其移动指数显著降低,表明痘苗病毒增强了人白血病细胞的抗原性,从而引起特异性细胞免疫增强。

人缺血脑组织中TNF-α和IL-1β的表达

目的 :检测人缺血脑组织中TNF α和IL 1β的表达。 方法 :将 13例脑梗死的死亡病例按发病时间分成 <2d、3～ 5d、 >5d3个组 ,以非缺血侧半球作为对照 ,用免疫组化染色法检测缺血脑组织中TNF α和IL 1β的表达。结果 :人脑缺血后缺血病灶中TNF α和IL 1β呈高表达 ,与正常侧脑组织相比较有极显著差异。TNF α和IL 1β表达细胞的分布与缺血灶相一致 ,呈局灶性分布。TNF α的表达高峰在病后 2d内。IL 1β表达高峰在病后 3～ 5d。在病后 5d ,缺血侧TNF α和IL 1β的表达与正常侧无显著差异。结论 :人类脑缺血组织中TNF α和IL 1β的表达与动物实验的结果相似 ,提示TNF α和IL 1β参与了脑缺血损伤 。

低硒大鼠心肌线粒体型硫氧还蛋白还原酶的活性和表达

目的探讨低硒状态下大鼠心肌线粒体型硫氧还蛋白还原酶(TR2)的活性和表达变化,分析体内硒水平改变对TR2活性的影响及其可能的机制。方法用低硒饲料喂养断乳2周的Wistar大鼠14周,分别采用生物化学方法、Western blot和Northern blot杂交检测心肌组织中TR2的活性改变及TR2蛋白、基因表达变化。结果低硒组大鼠心肌TR2活性降低至对照组的69.3%,差异有非常显著意义。蛋白杂交的峰面积密度扫描结果显示,常硒组为3 538,低硒组为2 167。Northern blot结果显示,低硒组与对照组差异无显著意义。结论低硒能够降低心肌TR2的活性和蛋白表达水平,但并不影响此酶的基因表达。提示低硒导致心肌TR2活性降低可能是由于TR2蛋白合成过程中SeCys插入减少所致。

柯萨奇B3病毒中国分离株VP1基因序列分析

目的 分析柯萨奇 B3病毒 (CVB3 )中国分离株编码主要中和抗原的 VP1基因序列。方法 用逆转录 PCR技术扩增 CVB3中国分离株的 VP1基因 ,通过 TA克隆法构建 p CR2 .1-VP1并进行核苷酸序列的测定分析。结果 测序发现 CVB3中国分离株与 CVB3 Nancy株 VP1基因均编码 2 93个氨基酸 ,二者存在 5 9个核苷酸差异 ,其中 10处影响到氨基酸的编码 ,其余均为同义变异。结论 CVB3中国分离株与 Nancy株 VP1基因序列存在一定的差异 。

脑神经肽对人胚神经细胞生长发育及对小鼠急性缺血脑组织的影响

目的和方法应用体外培养的人胚背根神经节和大脑皮层神经元，研究了神经肽对神经组织和神经细胞生长发育的影响，还通过小鼠的急性脑缺血模型研究神经肽对急性脑缺血的作用。结果发现神经肽可使背根神经节突起的长度和密度增加，皮层神经元存活数增加，神经元分化率增高，胞体增大，突起延长，细胞生长加快。超微结构观察显示神经肽可增强细胞内的合成代谢和细胞间连接。脑神经肽可使小鼠脑组织水肿较轻神经元无明显空泡，细胞超微结构改变较轻微，脑组织LDH活性高于对照组。结论神经肽对神经组织具有营养作用，并对急性脑缺血也具有保护作用。

H9c2细胞对B组柯萨奇病毒3型重组株的易感性

H9c2细胞是来源于大鼠胚胎心脏组织的成肌细胞系,B组柯萨奇病毒(group B Coxsackievirus,CVB)是心肌炎和扩张型心肌病的主要病原。本研究观察了CVB3在H9c2细胞中的感染性,探讨H9c2细胞是否可用于CVB致心肌疾病的实验研究。用整合了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或海肾荧光素酶(RLuc)的CVB3重组株EGFP-CVB3、RLuc-CVB3攻击H9c2细胞及大、小鼠原代心肌细胞和骨骼肌细胞,应用荧光显微镜、流式细胞术和化学发光技术观察感染细胞的EGFP和RLuc表达,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测病毒在核酸水平的表达。结果显示,在病毒攻击的H9c2细胞未检测到EGFP和RLuc表达;RT-PCR显示在CVB3感染9 d后检测不到CVB3 RNA;CVB3毒株可感染小鼠心肌细胞、骨骼肌细胞和大鼠心肌细胞,但不感染大鼠骨骼肌细胞和H9c2细胞。本研究结果表明,H9c2细胞不是CVB3易感细胞,不能用于CVB3致心肌疾病的研究;该结果从病毒感染方面也支持H9c2具有大鼠骨骼肌细胞表型。

1,6-二磷酸果糖对阿霉素所致大鼠心肌损伤的影响

目的 研究 1,6-二磷酸果糖 (FDP)对阿霉素 (ADM)导致大鼠心肌损伤的影响。方法 采用 Wistar大鼠 3 6只 ,随机分为 ADM组、ADM+ FDP组及对照组。实验 3 0 d后进行心肌光镜病理形态学观察 ,测定血清及心肌超氧化物歧化酶 (SOD)、肌酸激酶 (CK)、乳酸脱氢酶 (L DH)的活性及脂质过氧化物 (L PO)的含量。结果 光镜下 ADM+ FDP组病理损害程度较 ADM组轻 ;各组之间心肌及血清 CK、L DH差异无统计学意义 ;和 ADM组比较 ADM+ FDP组血浆、心肌 L PO含量显著降低 ,而 SOD活性显著增加。结论 FDP对

柯萨奇病毒B3型3D蛋白抗体的制备

肠道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶。柯萨奇病毒B3型(coxsackievirus B3,CVB3)主要感染心脏,其3D蛋白在心肌表达中的时序和分布尚不清楚。本研究将通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的CVB 3D片段插入pET28a(+)的表达框,获得pET28a(+)-3D重组质粒。异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导pET28a(+)-3D表达3D-His蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,切胶,获得3D-His蛋白。3D-His蛋白加佐剂免疫新西兰大白兔制备3D蛋白多克隆抗体,蛋白免疫印迹法检测抗体效价及特异性。结果显示,本研究获得了高效价且特异性好的抗CVB3 3D蛋白抗体,可用于CVB3 3D蛋白功能的后续研究。

柯萨奇病毒B组3型VP1基因的体外表达和鉴定

将克隆的CVB3VP1基因亚克隆至真核表达载体 pCEP4构建CVB3VP1的真核表达质粒 pCEP4 CVB3VP1。pCEP4 CVB3VP1转染HeLa细胞 ,蛋白印迹试验证明该表达体系可以在体外表达能为CVB3中和抗体识别的VP1蛋白。

抗B组柯萨奇病毒3型3C蛋白多克隆抗体的制备及初步应用

目的制备抗B组柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CVB)3C蛋白的多克隆抗体。方法通过聚合酶链式反应从pcDNA3.1(+)-EGFP-3C中扩增编码3C的DNA片段,构建pET28a(+)-3C-6His表达载体,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli,E.Coli)BL21(DE3)以表达3C重组蛋白。优化表达条件及菌体蛋白的提取方法,经超声破碎制备菌体总蛋白,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,用氯化钾进行胶染色,切胶回收相对分子质量为26000的蛋白,即纯化的3C重组蛋白(3C-6His的相对分子质量为26000)。用纯化的1 mg 3C重组蛋白加等量弗氏佐剂免疫新西兰大白兔,共免疫5次,每次间隔1周,免疫结束后1周取兔血清,检测抗体的特异性。结果在相对分子质量为26000的位置检测到了3C-6His融合蛋白的表达,成功构建了高效表达带His标签的3C重组蛋白载体。重组3C蛋白原核优化表达条件为37℃培养细菌6 h,加0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导。经SDS-PAGE分离菌体总蛋白,得到了纯化的3C重组蛋白。获得的兔免疫血清可以结合E.Coli及HeLa细胞表达的3C蛋白,还能识别感染CVB3或肠道病毒A71的HeLa细胞中表达的3C蛋白。结论获得了抗CVB33C蛋白酶的多克隆抗体,这一抗体可特异结合肠道病毒的3C蛋白酶,为进一步研究3C蛋白酶在肠道病毒致病机制中的作用奠定了基础。

Vpr蛋白及HIV感染性心肌病研究进展

扩张型心肌病是HIV感染的常见并发症.Vpr是HIV-1的辅助基因vpr编码的蛋白,与HIV感染细胞的凋亡密切相关.大量存在于AIDS患者血循环中的可溶性Vpr可能导致AIDS患者心肌细胞凋亡.转基因鼠研究证实Vpr在心肌细胞过量表达会导致心率失常及充血性心力衰竭.上述研究提示Vpl与HIV心肌病的发生有密切关系.

影响以问题为基础学习教学方法成效的关键因素

以问题为基础的学习（problem—based leaning，PBL）是以学生为中心、基于问题的、学科交叉的教学方法。成功的PBL是学生通过自主讨论过程获得多学科融合的知识，同时培养分析和解决问题的能力以及交流能力等多种能力。在实践中发现，一个以系统为基础的垂直整合的课程计划，辅以适当的硬件设备，10人以下的分组规模，编写严密的案例，培训良好的指导教师和学生，对于PBL教学效果具有较大的影响。

横向整合课程体系和以问题为基础学习教学方法在基础医学教育中的应用

目的建立基于器官系统的基础医学的横向整合课程体系，采用以问题为基础学习教学方法，帮助学生理解、融合各学科的知识，从而培养学生的自主学习能力、批判性思维、交流能力和团队精神，提高学生的综合素质。方法将基础医学学科横向整合为基础医学导论模块、8个系统模块及一些专题，采用以问题为基础学习教学方法在部分七年制学生中进行试点。结果经过近2年的教学实践发现，学生在运用知识分析和解决问题、交流沟通能力方面明显好于没有参与教学改革的学生。结论横向整合课程体系与以问题为基础学习教学方法可以提高学生的多种能力，而更新教师的教育观念并强化专家型教学指导委员会的作用，对新课程体系和新教学方法的顺利实施具有重要的作用。

B组柯萨奇病毒感染对H9c2细胞microRNA表达谱的影响

目的观察B组柯萨奇病毒感染对大鼠心肌来源的H9c2细胞microRNA表达谱的影响。方法用B组柯萨奇病毒3型Nancy株（CVB3）攻击成层和未成层的H9c2细胞，6h后收获总RNA，基因芯片检测microRNA表达谱。结果比对未成层与成层的H9c2细胞的microRNA表达谱，H9c2细胞成层后有54种microRNA表达显著下调，7种microRNA表达显著上调。与未感染病毒的未成层细胞比较，CVB3感染的未成层H9c2细胞有35种microRNA表达显著下调，9种microRNA表达显著上调。与成层H9c2细胞比较，CVB3感染成层H9c2细胞后，有20种microRNA的表达显著下调，16种microRNA的表达显著上调。结论细胞生长状态、CVB3攻击均显著改变了H9c2细胞microRNA表达谱。

5＇非编码区嘧啶富集区变异对B组柯萨奇病毒1型毒力的影响

目的 观察5＇非编码区（5＇UTR）嘧啶富集区变异对B组柯萨奇病毒1型（CVB1）毒力和致病性的影响.方法 定点诱变将CVB1基因组5＇UTR第563～573碱基嘧啶富集区5个嘧啶置换为嘌呤,获得突变株CVB1/m563-573.空斑纯化病毒后,利用细胞病变效应（CPE）试验、空斑形成试验、一步生长曲线和半数致死量（LD50）等方法比较CVB1/m563-573与其原型株CVB1/wt的毒力.结果 测序结果显示,CVB1/m563-573的5＇UTR嘧啶富集区发生C565A、U567C、U568A、U570A、U572G突变,与预期一致.CPE试验表明,CVB1/m563-573的感染性较CVB1/wt稍弱（A 490分别为0.710±0.074、0.812±0.092）,但差异无统计学意义（t=-2.204,P〉0.05）.空斑形成试验显示,46、58 h时间点CVB1/m563-573形成空斑的数量为（6.40±1.52）×103、（11.60±2.19）×103 pfu（空斑形成单位）/L,直径为（2.00±0.35）、（2.47±0.41）mm,CVB1/wt的空斑数量为（8.40±2.51）×103、（11.80±1.92）×103 pfu/L,直径为（1.80±0.27）、（2.85±0.44）mm,二者比较差异无统计学意义（t值分别为8.000、0.985、10.000、9.000,P均〉0.05）.一步生长曲线法显示,经过3、5、7 h的扩增,CVB1/m563-573所得的活病毒颗粒数（×103 pfu/L）的常用对数（lg）分别为2.10±0.09、4.28±0.03、7.44±0 CVB1/wt的活病毒颗粒数（×103 pfu/L）的lg值分别为2.80±0.02、4.77±0.02、8.55±0.01.CVB1/m563-573株在3个时间点均较CVB1/wt复制显著慢（t值分别为-13.151、-24.319、-47.714,P均〈0.01）.CVB1/m563-573和CVB1/wt的LD50分别为3.10×109、1.26×107 pfu/L,CVB1/m563-573致病力较CVB1/wt明显减弱.结论 减少5＇UTR嘧啶富集区的嘧啶碱基数量可致CVB1的感染和毒力减弱,该位点突变可能是研发CVB减毒活疫苗的策略之一.

柯萨奇病毒B组3型2B蛋白诱导细胞自噬及其基序鉴定

目的 探讨柯萨奇病毒B组3型（CVB3） woodruff病毒2B蛋白对细胞自噬的诱导作用,及其自噬相关基序的鉴定.方法 分别构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与CVB3 woodruff病毒2B蛋白及其9种截短蛋白的融合蛋白（EGFP-2B、EGFP-2B1-249、EGFP-2B1-201、EGFP-2B1-153、EGFP-2B1-105、EGFP-2B1-57、EGFP-2B106.201、EGFP-2B106-249、EGFP-2 B205-297、EGFP-2B106-201）真核表达载体,红色荧光蛋白（mCherry）与微管相关蛋白轻链3（LC3）的融合蛋白真核表达载体pmCherry-LC3;应用激光共聚焦与蛋白质免疫印迹（Western blot）检测病毒2B蛋白对宫颈癌细胞（HeLa） LC3表达的影响;荧光显微镜观察9种截短蛋白在HeLa细胞中的表达;Western blot检测pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后LC3的表达;观察自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-MA）处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249诱导细胞自噬的情况.结果 CVB3攻击HeLa细胞后,mCherry-LC3呈现细胞核周点状聚集表达,Western blot检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;pEGFP-2B与pmCherry-LC3共转染后也可见细胞核周围绿色荧光与红色荧光均成点状聚集并相互重叠,且LC3-Ⅱ条带明显;9种截短融合蛋白质粒分别转染HeLa细胞后,其中可见细胞核周围绿色荧光点状聚集的最短截短蛋白为EGFP-2B106-249;pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后可检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;3-MA处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249分别与pmCherry-LC3共转染的细胞均未见绿色和红色荧光的核周点状聚集.结论 CVB3 woodruff病毒2B蛋白可以诱导宿主细胞发生自噬,其中截短蛋白2B106-249是病毒蛋白2B诱导HeLa细胞发生自噬的功能基序.