酶联免疫吸附分析法在食品卫生分析中的应用

酶联免疫吸附分析法在食品卫生分析中的应用赵晓联蔡建荣（江苏省微生物研究所，无锡２１４０６３）酶联免疫吸附分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术主要的依据有三点：第一，抗原（抗体）能结合到固相载体的表面仍...

酶联免疫吸附法检测罂粟碱研究Ⅲ测试盒指标的确立及验证

目的:研究能检测食品中罂粟碱含量的酶免测试盒。方法:利用研制的罂粟碱抗体,罂粟碱酶标抗原以及相关的ELISA其它试剂,进行测试盒的各项技术指标的确证。结果:结果表明:测试盒的最低检测限:0.1ng/ml;定量检测范围:0.1～20ng/ml;精密度(批内CV%):5.7%～9.1%;样品加标回收率79%～123%;与类似生物碱的交叉反应率很低(<1.7%);测试盒4℃下保存期可达6个月以上;与HPLC法和免疫胶体金法对比实验表明,有良好的一致性。结论:研制的罂粟碱酶免测试盒能定性定量检测食品中的罂粟碱含量。

酶联免疫吸附法检测罂粟碱研究 (Ⅱ)抗体制备和酶标抗原合成

利用前文制备的罂粟碱 -牛血清白蛋白 (Pap -BSA)偶联物作为免疫抗原 ,免疫新西兰大白兔 ,获得效价为 1:3 2的特异性抗罂粟碱免疫球蛋白 (抗体 )。同时 ,合成了罂粟碱 -辣根过氧化物酶 (Pap -HRP)结合物 (酶标抗原 ) ,抗体和酶标抗原特性的鉴定结果令人满意。

酶联免疫吸附法测定饲料中黄曲霉毒素

黄曲霉毒素(Aflatoxins,简称AFT)是由真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一组强毒性的次生代谢产物,尤其是黄曲霉毒素B_1(AFB_1)为强污染物质,分布范围广,能引起人类(特别是儿童)、各种饲养动物的急性中毒死亡,还能致癌、致畸、致突变,即使每千克的物质含几十微克的量仍有很大的毒性。因此,对人和畜禽的健康威胁极大。AFB_1理化性质非常稳定,在高温200℃、紫外线照射下,都不能将其破坏,并通过食物链的作用,能从一种生物体转移到另一种生物体内。凡残留在家禽、家畜的肌肉、脏器、蛋、奶中的毒素,可随食物进入人体,导致人的中毒或致癌,因此引起了世界各国的高度重视,并制定了最高限量,作为饲料、食品等部门强制性监控指标。酶联免疫吸附法(ELISA)测定AFB_1是近20年来发展起来的一种新的分析方法,它比原BG8381- 87薄层荧光限量法(半定量)测定饲料中AFB_1具有技术先进、灵敏度高、特异性强、精确度高、重复性好、测定速度快、成本低、污染少、一次可测定大批样品、能限量和定量测定等优点。虽然研制技术比较复杂,但用于检测却十分方便。适于推广应用。

免疫亲和层析-液质联用法检测蓝藻中的微囊藻毒素

应用自制的微囊藻毒素(microcystin,MC)免疫亲和层析柱为净化工具,建立了固相萃取柱富集、免疫亲和层析柱净化、液质联用法检测蓝藻样品中MC的方法。结果显示:只用固相萃取柱富集,会残留大量杂质,干扰MC(尤其是MC-LR)的测定结果。而用免疫亲和层析柱净化能有效去除藻样中的杂质,排除干扰,通过液质联用法定量,能准确测定藻样中的微囊藻毒素-RR(MC-RR)和-微囊藻毒素-LR(MC-LR)。方法的检出限为2.5μg/L;线性范围为5～500μg/L;MC-RR和MC-LR平均回收率高于84%;相对标准偏差低于5%。

液相色谱-串联质谱法同时检测水中5种微囊藻毒素

[目的]建立高效液相色谱-串联质谱同时检测水中5种微囊藻毒素（MC）的方法。[方法]在流动相中加入甲酸，以亮氨酸-脑腓肽为内标，采用多反应监测模式（MRM）对5种MC进行定量检测。[结果]5种MC的检出限均低于0.1μg/L，平均回收率在91.2%-101.6%。此方法用于太湖水样的检测，3个水样中1个样品检出了MC-LR，含量为0.2μg/L，低于WHO饮用水中MC-LR为1.0μg/L的控制标准。[结论]该研究建立的高效液相色谱-串联质谱同时检测水中5种MC的方法灵敏度高、选择性好。

藻毒素的危害及分析方法进展

随着水体污染和富营养化程度的加剧,藻类“水华”危害日趋严重,本文简述了淡水中藻毒素的产生、化学结构及毒性机理,重点综述了检测藻毒素的各类分析方法以及最新的研究进展,尤其对目前国内外广泛应用的灵敏、高效的色谱分析方法(如HPLC/MC,GC/TMS/MS/CE)和更快速、更有效的免疫分析方法进行了详细的综述,提出了开发更新的仪器分析技术、生化分析技术、生物传感器等,及操作更简便、特异性更强、检测速度更快捷的免疫检测技术是今后藻毒素分析方法的发展方向。

微囊藻毒素(MC-LR)多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备针对藻毒素(MCLR)的多克隆抗体,并鉴定其特性。方法利用合成的免疫抗原MCKLH结合物,按常规方法免疫新西兰大白兔20周,经离心、硫酸铵沉淀法制得纯化的抗体,计算其亲和常数,用间接竞争法测定效价、抑制率IC50及特异性。结果纯化的MCLR抗血清效价大于25600,最低检出限为0.01ngml,IC在0.1～1ngml之间,与MCLW和MCLF的交叉反应率为0.1%～20%。

金标免疫层析法检测黄曲霉毒素B_1的方法

应用金标免疫层析法(GICA)研制的金标免疫试纸条对食品中黄曲霉毒素B1的检测,来确立该方法的各项技术指标。结果表明:方法的最低检测限:2.5ng/mL;金标免疫试纸条在4℃环境下可稳定10个月以上;与类似毒素AFB2、AFG2的交叉反应率分别是7.14%、6.25%;检测时间小于15min;GICA与ELISA方法的符合率达90%以上。该方法简便、快速,有较高的灵敏度,重复性好,特异性强,能定性或半定量检测食品中的黄曲霉毒素B1含量。

藻毒素免疫抗原的制备及鉴定

目的为建立藻毒素(MCLR)免疫学检测方法,制备具免疫功能的MCLR完全抗原。方法根据MCLR分子中的羧基和蛋白质分子中的氨基,利用“活泼酯法”和“碳二亚胺法”分别制备MCLRKLH(匙孔血蓝蛋白)免疫抗原和MCLRBSA(牛血清白蛋白)检测抗原。结果用紫外光谱法(UV)和Bradford蛋白含量测定法鉴定,结合物中MCLR与KLH、BSA的结合摩尔比为9.1∶1和9.4∶1。采用“皮下注射法”用MCLRKLH免疫新西兰大白兔15周,取血清,用“间接酶联免疫吸附法”(id-ELISA)鉴定抗MCLR多克隆抗体效价,最高达1∶25600。结论证明制备的MCLRKLH具有免疫性。

抗微囊藻毒素单克隆抗体胶体金标记物的制备及鉴定

目的制备抗微囊藻毒素(MC-LR)单克隆抗体胶体金标记物,并利用光谱分析来探讨结合物的合成机理。方法用杂交瘤技术生产并纯化的抗MC-LR的单克隆抗体,利用胶体金标记技术合成20nm粒径的胶体金与抗MC-LR单克隆抗体的结合物,通过光谱分析对偶联物中单克隆抗体的构象进行分析,ELISA法检测偶联物中抗体的免疫性。结果抗MC-LR单克隆抗体的效价达108,IC50抑制浓度为3ng/ml,为IgG2a亚型,分子量为1·5×105,与MC-LW、MC-LF无明显交叉反应。胶体金与抗体偶联物的颗粒圆整,光谱分析结果显示抗体蛋白的特征官能团没有发生明显变化,与胶体金粒子作用后结构略加紧密。ELISA结果显示偶联物仍然保持免疫原性。结论抗MC-LR单克隆抗体胶体金标记偶联物中抗体蛋白结构和抗原决定簇的位点没有改变,仍具有免疫原性,偶联物的稳定性良好。

国内微囊藻毒素毒理学研究进展

微囊藻毒素对人类已产生潜在的危害,正日益受到公众的广泛关注,而国内对微囊藻毒素的毒理学研究已取得了较大的进展,微囊藻毒素对肝癌的促进作用已进入了分子水平的机制研究,对其它脏器的毒理学研究也逐步深入。文章对近十几年来该研究进展进行了综述。

ELISA法检测五类食品中黄曲霉毒素B_1前处理方法的改进研究

用酶联免疫吸附法(ELISA)检测五类食品(酱油、醋、面粉、大米、食用油)中黄曲霉毒素B_1(AFB_1)含量,关键在于样品的前处理。本文针对五类食品中AFB_1的前处理作了方法学研究。结果表明,改进后的前处理使检测灵敏度达0.1μg/kg,在0.1～10μg/kg之间呈良好线性关系,平均回收率在75%～170%之间。

黄曲霉毒素B_1的高灵敏时间分辨荧光免疫分析

采用时间分辨荧光技术建立了高灵敏的黄曲霉毒素B1(AFB1)间接竞争免疫分析法(AFB1-TRFIA)。以AFB1-BSA为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗AFB1抗体;AFB1与辣根过氧化酶的联结物(AFB1-HRP)包被96孔板为固相抗原,与游离AFB1共同竞争有限的抗AFB1抗体;用稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪。该方法的灵敏度为0.01μg/L,测量范围为0.01—100μg/L,批内和批间变异分别为4.1%和6.8%,平均回收率为97.2%,与黄曲霉毒素B2的平均交叉反应为10%左右;黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B及HRP基本不干扰本方法对AFB1的检测。8条不同时间进行的AFB1-TRFIA的效应点值ED80、ED50、ED20分别为(0.07±0.01)μg/L、(0.63±0.02)μg/L和(12.5±0.47)μg/L。比较AFB1-TRFIA和AFB1-ELISA检测AFB1,两者的相关系数为0.917。研究表明,AFB1-TRFIA是目前报导的AFB1检测中最灵敏的方法,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景。

单分散性胶体金的制备工艺优化

目的 利用磁力搅拌器作为加热和搅拌设备 ,研究了单分散性胶体金的制备工艺。方法 通过三因素三水平正交实验 ,确定最佳制备条件 ,并采用UV visible吸收光谱和透射电镜进行综合评价。结果 粒径为 11nm胶体金的最佳制备条件是溶液起始沸腾时间 2min ,加入还原剂后再继续加热反应时间是 6min ,反应过程中的搅拌转速为 10 0 0r min。此条件下得到的胶体金平均粒径为 10 .7nm ,标准偏差为 1.5nm。

ELISA法检测赭曲霉毒素A的改进研究

针对ELISA法检测赭曲霉毒素A(OTA),使用微振荡酶标板可以缩短免疫反应检测时间约30min。采用ELISA方法检测小麦样品中的OTA时,使用空白样品提取液来配制OTA标准溶液可以消除样品基质造成的干扰。同时对提取溶剂加以改进,采用NaCl-水-甲醇(10%:70:30)作为提取溶剂的提取效率最高。0.1、1、10μg/kg三个浓度水平的加标回收率为95%～110%,方法的重现性很好,变异系数小于10%。

微囊藻毒素-LR免疫亲和层析柱的研制和应用

用CNBr-activated Sepharose4B和微囊藻毒素-LR的单克隆抗体制备了免疫亲和层析柱,测得抗体偶联率在75.7%～94.1%之间。制得的免疫亲和层析柱最大柱容量在76～95ng之间,柱空白为0,回收率在90.8%～105.1%之间。柱子再生重复使用6次后,回收率不低于75%。建立了免疫亲和层析柱-高效液相色谱测定水样中的微囊藻毒素-LR的方法。该法检出限为5ng/L;线性定量范围为10～500ng/L。实验结果显示,免疫亲和层析柱特异性好,一次净化能除去绝大部分干扰物,净化效果明显优于现有的固相萃取柱。