检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-timeRT-PCR)。方法基于HEVORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化。采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性。结果优化出1对引物和探针的组合。优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U。优化的反应条件为:50℃30min;95℃3min;95℃10s,50℃30s,72℃60s,5个循环;95℃10s,57℃40s,40个循环。初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102。结论所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。

胰腺导管腺癌患者血清中microRNA-155的表达及其临床意义

目的检测microRNA-155(miR-155)在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)组织中、患者血清中的含量,探讨其作为PDAC血清学诊断标志物的可能性。方法应用荧光实时定量PCR法检测miR-155在20对PDAC组织和癌旁组织、70例PDAC患者和40例健康人血清、10对荷人PDAC小鼠和对照组小鼠血清及6株PDAC细胞株和其培养上清中的含量。结果实验结果显示,PDAC组织中miR-155表达高于癌旁胰腺组织(P=0.005);并且miR-155在PDAC患者血清中表达量高于健康对照组(P=0.004);在荷人PDAC小鼠血清中miR-155含量高于对照组小鼠(P=0.012);同时,6株PDAC细胞株miR-155的表达存在差异(P=0.000),miR-155在细胞内和在其培养上清中的表达具有高度一致性(r=0.628,P=0.005)。结论 miR-155在PDAC组织和患者血清中表达上调,提示其可能是PDAC血清学的潜在标志物。

铝佐剂理化特性及其吸附抗原后产物的质量控制研究进展

佐剂(adjuvant)是疫苗的重要组成部分,而铝佐剂(aluminum adjuvant)是目前应用最为广泛的人用疫苗佐剂。随着新检测技术的不断出现,对铝佐剂的化学组成、结构特点及其稳定性研究等有了更深入的了解。由于不同疫苗厂家铝佐剂的生产工艺各不相同,因此,制备的铝佐剂理化特性也有所不同。这导致了抗原被铝佐剂吸附后产物也存在很大差异。这种差异直接影响了疫苗的安全性和有效性。因此,越来越多的研究者针对佐剂吸附抗原后的含量、构象、结构完整性及稳定性等进行了探索。现就近年来对铝佐剂理化特性、抗原被铝佐剂吸附后产物的质量控制等研究数据作一概述,以期更深入地了解疫苗的研发和质量控制。

p-JNK JNK和PPARγ在食管癌变过程中的表达及其意义

目的:探讨p-JNK/JNK和PPARγ蛋白在食管癌变过程中的表达及其意义。方法:采用免疫组织化学方法,研究食管正常鳞状上皮(15例)、食管鳞状上皮内瘤变(85例)和食管鳞状细胞癌(60例)组织中p-JNK/JNK和PPARγ蛋白的表达情况。结果:JNK在食管正常鳞状上皮、食管鳞状上皮内瘤变和食管鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为20.0%、37.6%和55.0%,而p-JNK的阳性表达率分别为33.3%、55.3%和73.3%,JNK和p-JNK在食管鳞状细胞癌中的阳性表达率均明显高于食管正常鳞状上皮和食管鳞状上皮内瘤变(P<0.05)。高级别食管鳞状上皮内瘤变中JNK、p-JNK的阳性表达率显著高于食管正常鳞状上皮和低级别食管鳞状上皮内瘤变(P<0.05)。PPARγ在食管正常鳞状上皮、食管鳞状上皮内瘤变和食管鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为73.3%、45.9%和45.0%,食管鳞状上皮内瘤变和食管鳞状细胞癌中PPARγ的阳性表达率明显低于食管正常鳞状上皮(P<0.05)。食管鳞状细胞癌中JNK、p-JNK和PPARγ的表达与肿瘤分化程度相关,JNK、p-JNK和PPARγ的表达均随肿瘤病理分级的增高而降低(P<0.05)。JNK、p-JNK和PPARγ的表达与临床病理特征不相关(P>0.05)。结论:在食管癌变过程中,JNK、p-JNK的表达呈增高趋势而PPARγ的表达呈下降的趋势。但食管鳞状细胞癌中JNK/p-JNK和PPARγ的表达均随肿瘤分化程度降低而降低。提示JNK、p-JNK和PPARγ在食管鳞状上皮癌变和进展过程中发挥不同作用,其机制比较复杂。

胰腺导管腺癌中CD74的表达及临床意义

目的检测CD74蛋白在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)组织中的表达并探讨其临床意义。方法收集59例PDAC和23例慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的存档石蜡包埋标本。HE染色、镜下观察神经纤维周围淋巴细胞病灶。免疫组化检测CD74的表达,统计分析其与PDAC临床病理参数的关系。结果 PDAC神经纤维周围淋巴细胞病灶发生率为67.8%。CD74在肿瘤细胞中阳性表达率为61%(36/59),明显高于CP导管上皮(13%,3/23,P=0.000)。CD74表达与神经纤维淋巴细胞病灶密切相关(P=0.009),与其它临床病理参数无关。CD74阳性的PDAC患者术后生存时间明显短于CD74阴性患者(P=0.006 9)。CD74在肿瘤细胞中的表达(P=0.009;rs=2.590)及pT(P=0.022;rs=1.482)为影响PDAC患者预后的独立危险因素。结论 CD74在胰腺导管腺癌组织中高表达与神经纤维周围淋巴细胞病灶及肿瘤预后相关,可能成为PDAC预后相关的分子靶标。

我国家禽戊型肝炎病毒感染情况的调查

目的了解我国家禽戊型肝炎病毒(HEV)感染情况。方法自我国15个省份采集鸡和鸭血清共计1647份,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测血清中HEV抗原和抗体;通过Nested PCR对陕西、西藏和海南的全部血清样本及其它抗原阳性样本分别进行HEV及禽HEV核酸检测。结果 1507份鸡血清中有54份为HEV抗体阳性,26份为HEV抗原阳性,抗原和抗体的阳性率分别为3.58%和1.73%;140份鸭血清中10份为HEV抗体阳性,2份为HEV抗原阳性,阳性率分别为7.14%和1.43%;鸡和鸭HEV抗原、抗体阳性率无统计学差异。在鸡、鸭血清标本中没有检测到HEVRNA。结论我国家禽存在HEV感染,但还需要进一步研究以确定感染的病毒是否为禽HEV或1-4型HEV跨种感染。

人乳头瘤病毒(HPV)58型DNA疫苗免疫原性的初步分析

为了检测HPV58型不同L1基因的DNA疫苗的免疫原性,以pcDNA3.1为载体分别构建含HPV58型不同L1基因的DNA疫苗,命名为L1h、L1h△c、L1S、L1SM和L1wt。用免疫印迹法检测各DNA疫苗的体外表达情况;各重组质粒与pcDNA3.1-h58L2和pcDNA3.1-GFP共转染293FT细胞,检测其形成假病毒的能力;并将各DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠,利用假病毒中和实验检测中和抗体水平,用ELISPOT检测细胞免疫情况。结果显示,本实验成功构建了五种DNA疫苗,L1h△c的体外表达量最高,L1S和L1SM的表达量次之,L1wt没有表达;重组质粒L1S能够形成假病毒,而其他四种重组质粒均不能形成假病毒。L1S和L1h均可在小鼠体内诱导中和抗体,但L1S诱导的中和抗体的平均滴度为1:6400,明显高于L1h诱导的中和抗体水平(平均滴度为1:48),而其他疫苗在小鼠体内未产生中和抗体。对五种疫苗均未检测出特异性的细胞免疫反应。结果提示,体外能够组装成假病毒的DNA疫苗在免疫动物后可诱导高滴度的中和抗体,为今后DNA疫苗的筛选提供参考。

食管胃交界腺癌和远端胃癌KLF4 SP1及Cyclin D1表达的对比研究

目的:近些年研究发现胃食管交界腺癌的发生率较远端胃癌明显升高,但其发生机制目前并不清楚,本研究通过对比观察KLF4、SP1和Cyclin D1在食管胃交界腺癌和远端胃癌表达的差异,探讨食管胃交界腺癌发生的可能机制。方法:采用免疫组织化学染色法对比观察58例食管胃交界腺癌和47例远端胃癌组织中KLF4、SP1和Cyclin D1在蛋白水平上的表达差异以及与淋巴结转移的关系。结果:KLF4在远端胃癌组中的阳性表达率明显低于食管胃交界腺癌组(P<0.05);而且远端胃癌高中分化组和低分化组中KLF4的阳性表达率均明显低于相应食管胃交界腺癌组(P<0.05)。SP1在远端胃癌组中的阳性表达率明显高于食管胃交界腺癌组(P<0.05);而且远端胃癌高中分化组中SP1的阳性表达率均明显高于相应食管胃交界腺癌组(P<0.05)。Cyclin D1在食管胃交界腺癌组和远端胃癌组中的阳性表达率未见明显差异。进一步观察KLF4、SP1和Cyclin D1与淋巴结转移的关系,结果发现Cyclin D1的高表达与食管胃交界腺癌淋巴结转移有关;而KLF4、SP1和Cyclin D1的表达异常均与远端胃癌淋巴结转移有关。相关性分析结果显示在食管胃交界腺癌中KLF4与SP1和Cyclin D1之间未见明显相关关系;而在远端胃癌中KLF4与SP1以及KLF4与Cyclin D1(r=-0.334,r=-0.341,P<0.05)之间呈负相关;SP1与Cyclin D1之间呈正相关(r=0.340,P<0.05)。结论:食管胃交界腺癌和远端胃癌组织KLF4、SP1和Cyclin D1的表达和临床病理意义均存在一定差异,提示两种肿瘤在发生发展方面可能有所不同。

eIF4E在食管鳞状上皮癌变过程中的表达及意义

目的探讨eIF4E在食管鳞状上皮癌变过程中的表达及其意义。方法采用免疫组织化学方法,检测食管正常鳞状上皮(15例)、食管鳞状上皮内瘤变(85例)和食管鳞状细胞癌(60例)中eIF4E在蛋白水平的表达情况。结果eIF4E在正常食管鳞状上皮组织,食管鳞状上皮内瘤变组织和鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为26.7%、44.7%和63.3%,eIF4E在食管鳞状细胞癌中表达明显高于食管正常鳞状上皮组织及食管鳞状上皮内瘤变组织(P<0.05);高级别食管鳞状上皮内瘤变组织中eIF4E的阳性表达率显著高于正常食管鳞状上皮组织、低级别食管鳞状上皮内瘤变组织(P<0.05);低分化鳞癌组织中eIF4E的阳性表达率明显高于高分化鳞癌组织(P<0.05)。eIF4E的表达与临床病理特征不相关(P>0.05)。结论在食管鳞状上皮癌变过程中,eIF4E的表达呈增高趋势。eIF4E在食管鳞癌中的表达随肿瘤分化程度降低而增高,提示eIF4E在食管鳞状上皮癌变和进展过程可能发挥一定的作用。

戊型肝炎患者T淋巴细胞亚群的变化

目的探讨戊型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群的变化及其免疫学意义。方法应用流式细胞仪检测136例急性戊型肝炎患者及13例正常人群的外周血T细胞亚群。结果戊型肝炎患者与正常人比较,T淋巴细胞亚群变化无统计学差异(P>0.05)。单纯戊型肝炎病毒感染组的CD3+细胞总数、CD4+和CD8+细胞绝对数均高于重叠乙型肝炎病毒感染组(P均<0.05)。结论戊型肝炎病毒感染患者存在宿主细胞免疫功能的改变,这可能与急性戊型肝炎肝细胞损伤和清除病毒有关。

淋巴细胞免疫表型质控品的初步研究

目的研究液氮冻存对外周血单个核细胞(PBMCs)CD4+T和CD8+T百分比的影响,探索冻存PBMCs作为淋巴细胞免疫表型质控品的可行性。方法收集健康成人抗凝全血,用淋巴细胞分离液分离PBMCs后液氮冻存。定期复苏PBMCs检测CD4+T和CD8+T百分比,计算细胞存活率、回收率。并分析不同厂家试剂、复苏方法、固定时间等因素对CD4+T和CD8+T百分比的影响。结果液氮冻存0～12个月、12～24个月的PBMCsCD4+T和CD8+T百分比均保持在稳定水平。冻存12个月PBMCsCD4+T和CD8+T百分比的平均变异系数(CV)分别为14.5%和9.8%,细胞存活率为85.4%～94.3%,回收率33.3%～97.8%;冻存12～24个月PBMCs的CD4+T和CD8+T百分比的平均CV值分别为7.1%和6.5%,细胞存活率为88.3%～98.5%,回收率52.3%～101%。不同复苏方法和检测试剂的结果相对稳定,CD4+T和CD8+T百分比的平均CV值分别为8.1%和6.4%。复苏后的PBMCs经多聚甲醛固定可在48h内检测。结论液氮冻存的PBMCs有望作为淋巴细胞免疫表型测定的质控品。

不同人类免疫缺陷病毒感染途径群体中戊型肝炎病毒的流行情况

本研究旨在了解不同人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染途径群体中戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）抗体情况，探讨HEV疫苗接种的必要性。采集HIV感染者的血清或血浆，利用酶联免疫吸附试验（enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA）检测HEVIgG抗体、IgM抗体及抗原，荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测HEV核酸，Roche高纯化HIV-1核酸定鼍检测试剂盒（PCR荧光法）检测HIV感染者的HIV载量。比较分析不同HIV感染途径群体中HEV流行率的差别。结果显示，HIV感染者中HEV IgG抗体的阳性率为37．4％，静脉吸毒、成分献血和传播途径不明HIV感染群体的HEVIgG抗体阳性率分别为49．3％、39．5％和30．4％。HEV核酸荧光PCR检测结果均为阴性。3种HIV感染群体之间HEV IgG抗体阳性率差异无统计学意义（x2=2．978，P〉0．05）。HEVIgG阳性与阴性感染者之间HIV载量差异无统计学意义（P〉0．05）。结果提示，为保护HIV感染者免受HEV感染，应考虑接种HFV疫苗。

胰腺癌组织中SERPINB5的表达及意义

目的探讨SERPINB5在胰腺癌中的表达及其临床意义。方法利用组织芯片技术及免疫组化SP法检测SERPINB5在胰腺癌、癌旁组织与慢性胰腺炎组织中的表达,分析它与胰腺癌的临床病理指标间的相关性。结果 47例胰腺癌组织中SERPINB5的阳性表达率为85.11%(40/47),而16例癌旁及慢性胰腺炎组织中SERPINB5的阳性表达率为25%(4/16),两者比较差异有统计学意义(P<0.05);SERPINB5在胰腺癌组织中的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤组织学类型及神经浸润均无关(P均>0.05)。结论 SERPINB5阳性表达与胰腺癌相关,提示SERPINB5可能在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。

不同试剂检测北京地区健康献血者淋巴细胞CD3^+CD4^+、CD3^+CD8^+百分比参考值调查

目的探讨北京地区健康献血者CD3+CD4+、CD3+CD8+百分比的参考值范围,并对国产和进口的淋巴细胞免疫表型双染试剂进行比较。方法收集北京地区500例健康献血者全血标本,分别使用进口和国产的CD3FITC/CD4PE和CD3FITC/CD8PE双染试剂,应用同一台流式细胞仪进行检测,并对不同性别、民族和年龄段的结果以及不同试剂的结果进行比较。结果进口试剂检测的北京地区健康献血者CD3+CD4+、CD3+CD8+百分比以及CD3+CD4+/CD3+CD8+的范围(95%可信限)分别为22.92～49.96、14.86～41.70、0.37～2.47,不同年龄段(18～29、30～39与40岁以上组)各项指标均值的差异有统计学意义(P<0.05),而不同性别的比较仅CD3+CD4+(%)的差异有统计学意义(P<0.01),比较汉族(n=484)与少数民族(n=16)中各项指标的差异均无统计学意义(P>0.05)。国产与进口试剂的检测结果显著相关,CD3+CD4+(%)、CD3+CD8+(%)以及CD3+CD4+/CD3+CD8+的r值分别为0.970、0.953、0.967。u检验结果显示CD3+CD4+(%)的差异无统计学意义(P>0.05),而CD3+CD8+(%)、CD3+CD4+/CD3+CD8+的差异有统计学意义(P<0.01)。结论初步建立北京地区健康献血者CD3+CD4+(%)、CD3+CD8+(%)的参考值,参考值受年龄、性别、民族、检测试剂和仪器等多种因素的影响。国产和进口淋巴细胞免疫表型双染试剂检测结果基本一致,相关性具有显著性。

HEV经输血感染兔模型研究

目的建立输血感染戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)兔模型,了解HEV全血输注传播的可能性,并观察感染后的指标动态。方法以兔HEV接种4只SPF兔,经腹腔静脉窦采集抗凝血,然后立即以约10 m L/kg经耳缘静脉注射输血方式分别给予正常SPF受体兔5只,每周监测受体兔粪便和血清抗原、抗体和核酸,连续13周。结果静脉输血后,5只受体兔均出现粪便排毒,其中3只受体兔引起慢性戊肝,排毒时间超过13周,同时出现病毒血症和HEV抗原阳性,HEV抗体阴性或弱阳性;2只受体兔引起急性戊肝,排毒时间均小于6周,同时HEV抗体检测Sample/Cut-off(S/CO)值均大于13、HEV抗原阴性、无病毒血症。结论通过输全血方式可以感染兔,并引起急性或慢性HEV感染。

人胎盘部位滋养细胞肿瘤细胞系的建立及其鉴定

背景与目的:胎盘部位滋养细胞肿瘤(placental site trophoblastic tumor,PSTT)是一种特殊类型的妊娠滋养细胞肿瘤。该研究旨在建立人PSTT细胞系,鉴定其基本特性。方法:通过手术切除的PSTT组织标本原代培养,纯化并传代,建立人PSTT细胞系。鉴定方法包括:观察细胞形态,CCK-8法绘制细胞生长曲线,进行染色体核型分析,细胞与肿瘤组织短串重复序列(short tandem repeat,STR)分析,以及免疫组织化学染色。结果:建立稳定传代的人PSTT细胞系PSTT-1。PSTT-1细胞单层贴壁生长,失去接触抑制性,呈多突起的纺锤形结构。体外培养生长良好,每5 d传代1次,目前已传至30余代。染色体核型分析结果为正常女性核型:46,XX。PSTT-1与肿瘤组织STR分析结果高度匹配。PSTT-1细胞表达β-catenin、CD146、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)、人胎盘生乳素(human placental lactogen,hPL)和Muc4。结论:该研究成功建立人PSTT细胞系PSTT-1,为PSTT的研究提供了体外实验模型。

私分国有资产罪之主体构成要件要素探究及立法完善建议

我国在修订1997年刑法时增设私分国有资产罪这一罪名，该罪名设立十余年来，对遏制私分国有资产的行为起到了相当积极的作用。作为一名奋战在侦查前沿的检察院反贪部门干警，笔者欣喜地看到很多私分国有资产的罪犯被绳之以法，但欣喜之余也不乏忧虑和困惑，从事反贪侦查工作多年，笔者多次因主体身份问题让一些本可以成案的线索止步于初查阶段。由此，笔者对本罪之主体构成要件要素的争议问题进行了深入思考，并结合多年来从事反贪侦查工作的司法实践，提出相对应的操作性较强的立法完善建议。

基于稳定表达萤火虫荧光素酶Vero细胞系体外病毒中和活性检测方法的建立及应用

目的建立一种基于稳定表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)Vero细胞系的高通量检测方法,以评估样品的体外抗病毒中和活性。方法基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9靶向基因编辑技术,构建一种稳定表达fluc的Vero细胞系,在此基础上建立痘病毒和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染细胞活性检测方法,利用该方法评估痘病毒免疫血清及RSV单抗的中和活性,并与噬斑抑制法及细胞活力检测(adenosine triphosphate,ATP)法检测结果进行比较。结果成功构建了Vero-fluc细胞系,其细胞量与表达的fluc相关性良好(R^(2)=0.9948)。利用Vero-fluc细胞作为感染细胞验证的痘病毒中和活性检测方法具有良好的稳定性、可靠性[信噪比(signal/background ratio,S/B)=25],可满足高通量的检测需求(Z’=0.9),相比传统噬斑抑制法一致性强(R2=0.76),免疫血清的ID50值较噬斑法平均高出2倍。建立的RSV中和活性检测方法,检测的抗RSV单抗中和活性与ATP活性试剂盒检测结果一致,Vero-fluc细胞法在1∶103~1∶105的抗体滴度水平上抑制率显著高于ATP法。结论建立的基于Vero-fluc细胞系的病毒中和活性检测方法与传统方法相比,具有良好的相关性,结果可靠,且具有更高的灵敏度及检测通量,是一种通用型体外抗病毒中和活性评价方法。

不典型胎盘部位结节8例临床病理分析

目的探讨不典型胎盘部位结节的临床病理特征、诊断与鉴别诊断、治疗及预后。方法对8例不典型胎盘部位结节进行回顾性分析,观察其大体形态、显微镜下特征及免疫表型,复习临床病史并随访。结果 8例患者年龄26~42岁,平均32.8岁。临床症状包括宫腔占位、阴道不规则出血等;部分患者行宫腔镜检查示灰黄色占位性病变,镜下见病灶呈结节状,单发或多灶性,间质胶原化,内见轻度异型的绒毛膜型中间型滋养细胞,不伴肌层侵犯。其中3例免疫组化标记绒毛膜型中间型滋养细胞CK(AE1/AE3)、p63、HLA-G、β-catenin、GATA-3均阳性,Ki-67增殖指数8%~15%。8例患者中1例行全子宫切除,其他7例患者行宫腔镜下病灶切除,术后行超声、子宫内膜及子宫颈管内膜诊刮随访,未见病变进展。结论不典型胎盘部位结节易误诊为鳞状细胞癌、上皮样平滑肌肉瘤和其他滋养细胞病变,认识该病变最重要的意义在于避免误诊,影响临床处理和治疗。