橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

【目的】法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长c DNA序列,并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织:根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长c DNA序列,命名为TKFPS(Gen Bank登录号KJ558350.1)。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 k D,理论等电点(p I)为5.41,平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Target P亚细胞定位分析得知,TKFPS蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低。重组子p CAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。

橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达

克隆新疆野生橡胶草顺式异戊烯转移酶基因,对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究该基因的功能和植物体内天然橡胶合成分子机制奠定基础。采用同源克隆法结合RT-PCR技术获得目的基因,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。结果表明:该基因开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸,推测的蛋白分子质量为34.9ku,理论等电点为8.74;具有cis-异戊烯基转移酶的5个高度保守区,属于cis-IPPS superfamily蛋白家族;系统进化树表明,橡胶草顺式异戊烯基转移酶与短角蒲公英的亲缘关系最近;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。可见,利用RT-PCR技术从橡胶草叶片中克隆得到顺式异戊烯转移酶基因,成功构建原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到表达。

橡胶草高效再生体系的建立和优化

[目的]优化橡胶草再生和遗传转化体系。[方法]以橡胶草茎和叶为外植体,以1/2MS和MS为基本培养基,研究不同激素浓度配比、外植体类型和激素浓度对橡胶草不定芽诱导和生根的影响。[结果]橡胶草进行组织培养的最佳外植体类型为茎,诱导不定芽形成的最佳激素浓度配比为1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA。诱导不定芽生根的最佳激素浓度为0.10 mg/L NAA,生根率达100%,移栽成活率达95%以上。[结论]建立了橡胶草高效再生体系,对提高橡胶草组织培养的效率和转化率具有重要意义。

橡胶草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A基因表达的初步分析

分析橡胶草HMGR基因的表达情况,构建原核表达载体,转化BL21菌株并诱导表达。构建细胞融合表达载体,转化GV3101菌株并侵染洋葱表皮细胞,在共聚焦显微镜下观察基因表达情况。构建植物过表达载体并侵染烟草,利用紫外分光光度法检测三萜含量的变化。通过IPTG诱导和SDS-PAGE检测,获得分子量为62.659 1 ku的蛋白,与预期蛋白相符合,且37℃诱导6 h时表达最明显;通过激光共聚焦显微镜观察,该基因主要在细胞膜上表达;紫外可见分光光度法表明转基因烟草中三萜的含量高于空白烟草。橡胶草HMGR基因分别在大肠杆菌、洋葱鳞片内表皮和烟草中成功表达。

能源植物橡胶草TkGGPPS基因的克隆及表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是植物细胞萜类物质合成的重要调节靶点。利用RT-PCR和RACE技术首次从橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)中克隆得到一个GGPPS基因,命名为TkGGPPS(GenBank:KT028713),TkGGPPS cDNA全长1 140 bp,编码379个氨基酸。序列分析表明,TkGGPPS基因属于类异戊二烯超家族成员,其功能可能与萜类物质的合成有关。氨基酸序列同源性比对与系统进化分析表明,TkGGPPS与向日葵Ha GGPPS的亲缘关系较近,相似性为74.67%。实时定量PCR的结果表明,TkGGPPS基因在第6周橡胶草的主根和成熟的种子中显著表达。上述结果为进一步研究橡胶草产胶代谢途径和产胶合成相关基因功能提供一定的理论指导和技术支持。