“基因与健康:人类遗传密码”新生研讨课教学思考

指出了新生研讨课是近年来国内外高校兴起的教学模式,着重引导学生“自主学习”。以“基因与健康:人类遗传密码”新生研讨课为例,从“熟悉学生的知识背景”、“精心设计教学计划和教案”及“积极的考核和评价方式”这几个方面,总结了新生研讨课教学过程中的经验。以期进一步提高新生研讨课的教学效果,并为提升医学类新生研讨课的质量提供一些启发和思路。

猪源大肠杆菌(ETEC、STEC、AEEC)毒力基因及其与O抗原型的关系

【目的】揭示从我国部分地区仔猪腹泻或水肿病病猪体内分离到的300个大肠杆菌分离株所属病原型(pathotype)、毒力基因及其与O血清型的关系。【方法】O血清型采用常规的凝集试验进行测定,毒力基因采用PCR方法检测。【结果】通过对这300个分离株的O血清型及其毒素、紧密素和黏附素基因进行鉴定,结果显示除50株未定型、17株自凝外,测定出233个分离株的血清型,这些分离株覆盖了45个血清型,其中以O149、O107、O139、O93和O91为主,共133株,占定型菌株的57.1%;拥有estⅠ、estⅡ、elt、stx2e和eaeA基因的菌株分别为102(34.0%)、190(63.3%)、81(27.0%)、57(19.0%)和54(18.0%)株;分离株中有51株K88基因阳性(其中菌毛表达率为100%),75株F18基因阳性(其中菌毛表达率为50.7%),在K88菌株中,O149血清型与estⅠ或estⅡ+elt密切相关,在F18菌株中,O107血清型与estⅠ或estⅡ、O139血清型与stx2e紧密相关。依其毒力特征可将这些分离株分为以下6种类型:ETEC、STEC、AEEC、ETEC/STEC、AEEC/ETEC和AEEC/ETEC/STEC,分别拥有190、24、36、32、17和1个菌株,占分离株的63.3%、8.0%、12.0%、10.7%、5.7%和0.3%。通过分析这些分离株的O血清型、毒素类型和黏附素型之间的相关性:猪源ETEC以O149、O107、O93和O98等血清型为主,O149:K88菌株主要与estⅡ或estⅡ+elt肠毒素相关,O107:F18菌株主要与estⅡ相关,O93和O98血清型菌株主要与estⅡ肠毒素相关;STEC菌株以O139:F18血清型为主,拥有stx2e;AEEC菌株拥有紧密素,无明显优势血清型;ETEC/STEC菌株以O107:F18和O116:F18血清型为主,主要与estⅠ+stx2e或estⅡ+stx2e密切相关,ETEC/AEEC菌株以O91和O107血清型为主,全部拥有肠毒素estⅠ和紧密素基因。【结论】我国至少存在6种病原型的猪肠道致病性大肠杆菌,其中ETEC为我国部分地区猪大肠杆菌病的主要病原,同时其病原型日益复杂。

应用DNA芯片技术研究体外表达禽致病性大肠杆菌可能致病基因

应用DNA芯片研究禽致病性大肠杆菌可能致病基因的表达。构建禽致病性大肠杆菌毒力基因、潜在毒力基因的DNA芯片,应用基因芯片技术对同属O2血清型的禽高致病性大肠杆菌E058株和低致病性大肠杆菌E526株在体外LB培养基和鸡血清培养状态下进行差异表达分析。结果:在体外LB静置培养状态下,低致病株E526与高致病株E058相比共有16个差异基因,均为下调基因。在鸡血清静置培养中,E526与E058相比共有15个差异基因,均为下调基因。应用基因芯片成功筛选了禽致病性大肠杆菌在体外不同条件下的毒力基因及可能毒力基因中差异表达基因,表明一些铁摄取系统相关基因对APEC的毒力较重要,同时也筛选出了一些新的可能致病基因aes-1,aes-2,aes-3,aes-4,aes-6,aes-8,aes-10,aes-13,aes-15,aes-31等。

应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中分离的产气荚膜梭菌

目的用国标方法和多重PCR方法检测粪样和食品中产气荚膜梭菌分离株。方法采集粪样和食品样品按照国标方法进行分离鉴定,再应用多重PCR方法进行基因型鉴定。结果346份粪便样品分离与鉴定出了69株产气荚膜梭菌,275份食品样品分离到97株产气荚膜梭菌。经过生化试验鉴定和多重PCR方法鉴定,证实均为A型产气荚膜梭菌,携带β2毒素的产气荚膜梭菌共为53株,另检出了2株肠毒素阳性A型产气荚膜梭菌。结论初步摸清了我国的粪便中和食品中的产气荚膜梭菌的动态分布。并在食品中发现了导致人食物中毒的肠毒素阳性A型产气荚膜梭菌,为分子流行病学研究提供了重要理论依据。

禽源大肠杆菌的生物表型特性

对243株禽源大肠杆菌分离株进行血清耐受试验、菌毛化大肠杆菌血凝试验和温度敏感性血凝素试验,在这些分离株中,高度血清耐受、中等血清耐受、轻度血清耐受和血清敏感菌株分别占受试菌株的57.2%(139/243)、28.8%(70/243)、10.3%(25/243)和3.7%(9/243)。在37℃细菌培养物与鸡红细胞凝集试验中,甘露糖敏感血凝(MSHA)和甘露糖耐受血凝(MRHA)菌株分别占受试菌株的64.6%(157/243)和5.8%(14/243);与豚鼠红细胞凝集试验中,MSHA和MRHA菌株分别占受试菌株的74.9%(182/243)和2.9%(7/243),其中与鸡红细胞凝集试验MSHA菌株中,MSHA阳性菌株占高致病株的69.5%(132/190),MRHA阳性菌株占低致病株的22.2%(2/9),两者差异极显著(p<0.01)。在温度敏感性血凝素试验中,MRHA菌株为112株,占分离株的46.1%,其中O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分离株的83%～100%,而其它血清型的高致病株仅占57%左右,差异显著(p<0.05)。结果显示禽源大肠杆菌的致病性与其血清耐受能力、鸡红细胞MSHA菌毛的表达和温度敏感性血凝素的表达呈一定的相关关系。

食品专业免疫学教学新方法探索

指出了由于专业背景的差异,食品系学生在学习免疫学的过程中经常感到免疫学基础理论抽象、不易理解和难以记忆。这就要求免疫学专业教师采取合适的策略和方法,才能够取得理想的教学效果。结合食品系免疫学的教学实践,提出了教学新方法,包括以日常生活中的实例调动学习积极性;采用多媒体动画、及时互动等教学手段;提高理论的可接受性等,从而更好地传授学生免疫学学习方法,做到"授人以渔"。

尿道致病性大肠杆菌HEC4株和禽源致病性大肠杆菌E058株毒力相关特性的比较(英文)

对人尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)HEC4株和禽致病性大肠杆菌(avian pathogen-ic Escherichia coli,APEC)E058株进行毒力基因和其他相关特性的比较,结果显示,它们具有一些共同的毒力基因,包括一些存在于APEC中一个大的可传递质粒上的基因;同时,它们也具有一些相似的生化特性。对SPF鸡的致病性试验显示,这两株分离株具有相似的致病力。因此,对于APEC和UPEC的相关性,以及APEC是否有可能导致人尿道感染或者成为UPEC的毒力基因贮主,有待进一步研究。

浅谈移液器的维护与保养

移液器是每个实验室必不可少的精密仪器,它的准确度直接影响着实验结果。如何正确地使用与维护移液器,无论是对实验室,还是对实验人员,都显得尤为重要。

nklin大肠杆菌ompT基因的相对表达定量PCR方法的建立

目的建立ompT基因表达水平解析的定量方法。方法利用嵌合荧光（SYBR GreenI）标记，以编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的看家基因gapA为内参基因，建立用于ompT基因表达水平解析的两步法实时定量反转录PCR。通过大肠杆菌的鸡体内感染模型，获取感染菌体，利用该定量PCR对感染菌体中ompT基因在感染鸡体内的表达水平进行了解析。结果成功建立了ompT基因表达水平解析的定量PCR。定量PCR结果显示，相对于体外培养，APECE058株ompT在鸡体内的表达上调了6．69倍。结论建立的ompT基因定量PCR方法稳定、可靠，可用于ompT表达水平的解析。

粪样中产气荚膜梭菌的分离及cpe^+菌株的鉴定

目的分离粪样中的产气荚膜梭菌基因分型。方法按照国标方法从粪样中分离产气荚膜梭菌,应用PCR进行毒素基因型分型和鉴定。结果从1 411份粪样中分离到557株产气荚膜梭菌,其中553个为A型,其余为C型。1株人源分离株携带cpe基因,该cpe的ORF与标准菌株在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为99.9%和100%,而且该基因位于染色体上。结论初步摸清了我国粪样中产气荚膜梭菌的动态分布,并在人粪样品中发现了cpe+产气荚膜梭菌,为分子流行病学研究提供了重要理论依据。

大肠杆菌ftsK基因的相对表达定量PCR方法的建立

利用嵌合荧光标记，建立了用于ftsK基因表达水平解析的两步法实时定量PCR。利用该方法对ftsK基因在感染鸡体内的表达水平进行了解析。结果表明，相对于体外培养，APECE058株ftsK在鸡体内的表达上调了23．57倍。

携带IL-7的新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗对肝癌的免疫治疗效应

目的研究携带IL-7的新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗的抗肝癌作用。方法鸡胚扩增新城疫病毒LX/(IL-7),体外感染Hepa1-6细胞,显微镜下观察LX/(IL-7)的裂解性特征,并采用ELISA的方法检测感染Hepa1-6细胞后IL-7的表达水平;将C57BL/6小鼠分为2组,每组5只,通过皮下接种5×106个Hepa1-6细胞建立小鼠肝癌模型。成瘤1周后,200μg/ml丝裂霉素C处理的2×107/ml Hepa1-6细胞感染LX/(IL-7)病毒制成肿瘤疫苗。对照组小鼠皮下接种丝裂霉素C处理的Hepa1-6细胞,每只接种1×106个细胞,实验组接种瘤苗,每只接种1×106个细胞,每周2次。测量肿瘤体积,通过流式检测小鼠脾脏细胞免疫反应。结果 LX/(IL-7)病毒具有非裂解性特征,可以高效地感染肝癌细胞并分泌IL-7。肝癌皮下模型的结果表明LX/(IL-7)修饰的Hepa1-6瘤苗具有较好的肿瘤免疫治疗效果,流式结果显示其可增强效应T细胞的比例,促进T细胞的免疫应答。结论携带IL-7的新城疫病毒修饰的自体肿瘤疫苗具有显著抗肝癌作用。

携带TGF-βⅡ型受体及NKG2D融合基因的NK-92细胞生物学特性研究

目的构建携带TGF-βreceptorⅡ(TGF-βRⅡ)胞外段跨膜区及NKG2D胞内段融合基因的NK-92细胞,并检测其生物学特性。方法通过RT-PCR从人外周血淋巴细胞中扩增出TGF-βreceptorⅡ胞外段跨膜区及NKG2D胞内段基因;利用PCR的方法将2段基因融合,并构建含有融合基因的慢病毒穿梭质粒;将该质粒与包装质粒共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒并感染NK-92细胞系,筛选出稳定转染的NK-92细胞系;采用流式细胞术检测目的基因在转染后的NK-92细胞系中的表达,用CCK-8的方法检测24 h和48 h时NK-92-TN的存活能力,同时用Transwell的方法检测NK-92-TN的迁移能力。结果测序表明,成功获得了TGF-βRⅡ胞外段跨膜区与NKG2D胞内段的融合基因;获得了重组慢病毒;通过筛选得到了可稳定表达融合基因的NK-92细胞系,同时NK-92-TN的存活能力和迁移能力要明显优于对照组。结论成功建立表达TN的NK-92细胞系,并且发现NK-92-TN的存活能力和迁移能力明显优于对照组,从而为NK-92-TN细胞的体内生物学功能的研究工作奠定了基础。

AIDA-1基因的克隆与鉴定

为了克隆AIDA-1基因并对其定序,通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1基因,通过酶切的方法克隆到pMD19-T simple载体中,再转化入感受态大肠杆菌,并通过基因测序的方法测定了AIDA-1的序列。结果表明:成功克隆并测定了AIDA-1的序列,为蛋白展示、疫苗开发提供了重要的材料。

浅谈医学院肿瘤学教学相关经验

肿瘤学是医学院的重要课程,由于医学院学生自身的特点,使得肿瘤学的教学具有自身特殊性。笔者总结自身的肿瘤学教学经验如下:针对医学院学生的特点,选择合适是的讲解内容;通过熟悉事例,提高学习兴趣;多媒体教学生动形象的展示,提高教学效率;教学与实验相结合,强化教学内容;临床实践与教学相结合,开阔学生视野。希望通过本文与广大教育工作者交流经验,以期提高我国肿瘤学教学水平。

抗CD40单链抗体的慢病毒载体的构建和表达

目的克隆大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv),并构建可表达大鼠抗小鼠的抗CD40抗体的单链抗体(CD40-scFv)的重组慢病毒。方法采用RT-PCR法从分泌大鼠抗小鼠抗CD40激活型抗体的杂交瘤细胞株(FGK-115)中克隆VH和VL基因,用重叠延伸PCR法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD40抗体的scFv基因,将CD40-scFv基因连接至PEGM-T克隆载体,限制性内切酶酶切及测序鉴定;构建含有大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv)的慢病毒穿梭质粒,并与其它包装质粒一起通过磷酸钙法感染293T细胞;获得病毒颗粒并感染人慢性髓系白血病细胞MEG-01,检测其感染效率。结果含大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv)的慢病毒穿梭质粒构建成功;通过磷酸钙感染293T细胞所得病毒上清可成功感染MEG-01细胞,流式细胞术检测阳性率可达96%。结论成功克隆了大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体(CD40-scFv)基因,并建立其重组慢病毒表达系统,为后续的实验及应用研究工作奠定了基础。

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35(IL-35)基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b(+),并转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b(+)-IL-35在BL21(DE3)中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。