橡椀单宁提取工艺优化及其动力学和热力学研究

以橡椀壳粉为原料,采用工业纤维素复合酶辅助提取橡椀单宁,在单因素试验基础上通过响应面法优化提取工艺,进一步研究水酶法提取过程中对应的动力学和热力学模型。研究结果表明:橡椀单宁的最佳提取溶液pH值5.0、1.00 g橡椀壳粉、料液比1∶50(g∶mL)、提取时间27.7 min、提取温度55℃、酶用量为橡椀壳粉质量的1.9%,此条件下单宁提取率为97.56%。在该优化工艺条件下,原料质量放大至90 g时,单宁提取率仍达到97.3%,且提取物中单宁质量分数为55.0%、总多糖质量分数为5.16%、总黄酮质量分数为2.95%。动力学和热力学研究表明:单宁提取过程符合Fick第二定律,293~353 K范围内,速率常数(k)为0.1220~0.2596 min^(-1),表观活化能(E_(a))为10.683 kJ/mol,指前因子(A)为9.6,提取过程的焓变(ΔH)为28.584 kJ/mol、熵变(ΔS)为110.576 J/(mol·K)、吉布斯自由能变(ΔG)为-8.652~-4.074 kJ/mol,表明该提取过程可自发进行,升高温度有利于橡椀单宁的提取。

极耐热α-L-鼠李糖苷酶的性质及其在异槲皮素制备中的应用研究

L-鼠李糖苷酶可特异性切除糖苷类化合物上连接的α-L-鼠李糖基,已被广泛用于食品、医药等工业领域。作者旨在获得耐受高温的α-L-鼠李糖苷酶,提高工业生产的效率和降低使用成本。首先对嗜热菌Sulfolobus islandicus来源的α-L-鼠李糖苷酶基因进行克隆及大肠杆菌的异源表达,随后测定了系列酶学性质,接着优化了该酶制备异槲皮素的酶法制备工艺。结果表明:重组酶SisRha在90℃下酶活力最佳,具有极好的热稳定性,其在80℃下孵育120 min后酶活力几乎没有损失;最适反应pH为5.5,在pH 4.5~7.0时,pH稳定性良好;重组酶SisRha对人工底物对硝基苯酚鼠李糖糖苷(p NPR)的Km值为(0.15±0.03) mmol/L,Vmax值为(6.26±0.51)U/mg,k_(cat)值为(10.48±0.86) s^(-1);对底物p NPR、芦丁、朝藿定C、柚皮苷、橘皮苷和淫羊藿苷的比活力分别为25.06、11.89、6.74、3.14、2.77、0.42 U/mg。重组酶SisRha转化芦丁生成异槲皮素的适宜工艺为:用酶量0.40 U/mL,在85℃、pH 5.0的条件下反应1 h,可将2 mmol/L芦丁几乎全部转化,摩尔转化率高达98.56%。本研究丰富了现有的α-L-鼠李糖苷酶资源,为嗜热菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的研究奠定了基础,同时提供了一种高温转化芦丁制备异槲皮素的方法。

海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的研究

以海藻酸钠为载体,研究了β-葡萄糖苷酶固定方法及其条件,并利用固定化β-葡萄糖苷酶进行了酶解试验。结果表明,采用交联-包埋方式,在海藻酸钠质量分数3.5%、给酶量100 U/g载体、戊二醛体积分数1%、氯化钙质量分数2%的条件下固定β-葡萄糖苷酶2 h,可以获得较佳的固定化效果。其固定率达到65%,重复分批利用20次仍能保持90%以上的酶解得率。利用固定化β-葡萄糖苷酶连续酶解纤维二糖时,在不同进料速度下有着不同的催化效率,当进料速度为1.5 mL/m in、1.0 mL/m in时,酶解得率分别达到96.7%和99.0%;与木霉纤维素酶协同水解纤维素时,在β-葡萄糖苷酶总酶活与滤纸酶活之比为0.5(FPA为2.0 U/mL)的条件下,酶解滤纸纤维素和微晶纤维素60 h的得率比单独采用木霉纤维素酶分别增加了20.4%和29.3%。研究结果对于解决酶法水解纤维资源得率低、酶使用成本高这一关键问题提供了一种有效的方法。

白腐菌及黑曲霉所产的纤维素复合酶对稻草秸秆的生物降解

研究了白腐菌及纤维素复合酶对稻草秸秆的协同生物降解。结果表明,利用黄孢原毛平革菌固态发酵稻草秸秆的过程中,LiP和MnP的最大活力可以达到28.3U/g和12.6U/g,同时,秸秆中的木质素能被有效降解,但纤维素、半纤维素降解率较低。添加黑曲霉所产的纤维素复合酶能有效地促进秸秆腐熟程度。在接入白腐菌培养10d后,每克稻草添加3IU纤维素酶液并酶解48h可以使稻草秸秆中纤维素降解53.8%,半纤维素降解57.8%,木质素降解44.5%,干物质损失46.3%。此时细胞壁出现大范围破损,整个组织变得松散,秸秆完全腐熟。

利用七叶灵显色技术检验和判断β-葡萄糖苷酶的研究

七叶灵(6,7-2-羟基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)在β-葡萄糖苷酶的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原(6,7-2-羟基-香豆素),七叶苷原能和Fe3+作用呈现棕黑色。七叶灵显色技术用于β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选、β-葡萄糖苷酶提纯时的样品检测、非变性聚丙烯酰胺凝胶活性染色的应用结果表明,以七叶灵为作用底物检验和判断β-葡萄糖苷酶的新方法具有高分辨率和灵敏性,而且操作简易、快速、经济。

黑曲霉胞外耐高糖β-葡萄糖苷酶的分离纯化及部分特性研究

采用硫酸铵盐析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、DEAE-Sephamse阴离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析等步骤，从黑曲霉的发酵液中获得了凝胶电泳均一的两种β-葡萄糖苷酶。其中一种为耐高糖的β-葡萄糖苷酶，葡萄糖抑制系数（Ki）为41．01mmol／L，纯化倍数和得率分别为56．7倍和22．66％。耐高糖β-葡萄糖苷酶单亚基分子质量为114．6ku，以对硝基苯酚-β-肛葡萄糖苷（pNPG）为底物时，米氏常数（Km）值和酶促反应的最大速率（vmax）分别为0．904mmol／L和1．08μmol／min。该酶最适反应温度60℃，最适反应pH值为4．0；在60℃以下及pH值3—7范围内均能保持稳定。所测定的化学试剂中，Ag^＋对酶具有较强的抑制作用，其它金属离子及乙二胺四乙酸对酶的活性影响不大。甲醇、正丁醇有明显激活酶活性的作用，但乙腈、丙酮对酶的抑制作用明显。

碳源和氮源对黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶的影响

以黑曲霉(Aspergillus nigernl-1)为产酶菌种,研究了碳源和氮源对β-葡萄糖苷酶合成的影响。结果表明:麸皮为最好的碳源,适宜的使用量为4%;(NH4)2SO4、蛋白胨分别为较佳的无机氮源和有机氮源,由无机氮与有机氮组成的复合氮源更有利于β-葡萄糖苷酶分泌,其适宜比例为0.2%(NH4)2SO4和3.19%蛋白胨。通过碳源、氮源的优化,β-葡萄糖苷酶活力达到4.82 U/mL。

固定化漆酶对染料酸性紫43的脱色和降解

采用自制复合型载体丙烯酸酯类聚合物固定的漆酶对染料酸性紫43进行脱色处理。研究了固定化酶的用量、底物浓度、温度、pH对其降解效果的影响。结果表明，固定化漆酶脱色降解酸性紫43的适宜条件为：酶用量12．5U／mL，染料浓度150mg／L，反应的温度范围在45～55℃，pH值范围在4．5～5．0。在上述条件下降解4h，染料酸性紫43脱色率能达到98．5％。重复分批使用固定化漆酶处理染料酸性紫43，在使用8批次后，脱色率仍然能保持在90％以上，其催化效率得到了很大提高。

复合酶制剂降解植物性饲料的研究

研究了含有多种酶组分的高效复合酶制剂对植物性饲料的作用与影响。结果表明 ,复合酶制剂中纤维素酶、β—葡聚糖酶、半纤维素酶、果胶酶不仅能协同作用 ,破坏植物性饲料的细胞壁 ,使存在于细胞内的大分子营养源能够充分释放出来 ,而且可以降解饲料中的抗营养因子。同时 ,复合酶制剂中的蛋白酶、α—淀粉酶、糖化酶能够有效地降解蛋白质、淀粉 ,提高饲料中营养物质的利用率。在饲料中添加本产品时 ,适宜的酶用量为 1‰ ,且能够在较强的酸性条件下发挥作用。

β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及其所产纤维素酶酶系组成分析

从木霉属、曲霉属、担子菌等17种试验菌株中筛选出一株产β-葡萄糖苷酶活性较高的黑曲霉A.niger-nl-1。该菌株在适宜的培养条件下,β-葡萄糖苷酶的最高活力达到4.7U/mL,适宜的产酶周期为4d。制备的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为55℃、最适反应pH为5.0。该菌株除能产生β-葡萄糖苷酶外,还能产生内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶,滤纸酶活达到0.62IU/mL。

黑曲霉胞内β-葡萄糖苷酶分离提纯及其性质的研究

采用丙酮沉淀、DEAE—Sepharose阴离子交换层析、SephacrylS-200凝胶过滤、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析等步骤，从黑曲霉菌丝体中获得了一种凝胶电泳均一的胞内β-葡萄糖苷酶，其单亚基相对分子质量为122．7k，纯化倍数和得率分别为7．2和19．3％。以纤维二糖为底物时，该酶葡萄糖的抑制常数Ki为0．19mmol／L，Km值和Vmax分别为2．99mmol／L、1．49μmol／min。该酶最适反应温度60℃，最适反应pH为5．0；在60℃以下及pH3～6范围内均能保持稳定。甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂对胞内β-葡萄糖苷酶有很好的激活作用。

黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶过程中pH值的调控

研究了初始pH值对黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的影响,并对产酶过程中pH值进行了人工调控。结果表明,利用黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的最佳初始pH值为5.0;使用氢氧化钠稀溶液能有效地对产酶过程中的pH值进行调控;将产酶期的pH值控制在4.0左右时,有利于β-葡萄糖苷酶的分泌,发酵120 h,酶活力能达到6.12 U.mL-1,大大高于调控前的酶活力。对黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶工艺的制定及提高β-葡萄糖苷酶的产率具有重要的指导作用。

不同性质的木聚糖底物定向酶解制备木低聚糖的研究

比较了在相同的条件下 ,含盐和不含盐的底物、含木素和不含木素的底物、聚合度和糖基比不同的底物在木聚糖酶的作用下 ,定向制备木低聚糖时的木低聚糖得率、木糖得率、总糖得率 ,阐明了氯化钠、木素的存在以及木聚糖支链、木聚糖聚合度的差异对实验结果的影响。从而为制定木聚糖和木低聚糖的最佳生产工艺提供理论依据。

银杏叶生产饲料复合酶的固态发酵条件及产物分析

研究了以银杏叶为原料,黑曲霉为菌种生产饲料复合酶的固态发酵条件,分析了发酵产物中主要营养成分和活性成分的变化。结果表明,适宜的工艺参数为:浅盘发酵的料层厚度4cm,初始含水率为64.3%,培养基初始pH值5.0,接种量2.5%,培养温度28～30℃。银杏叶通过生物转化后营养丰富,生物活性增强。其中,粗蛋白、总氨基酸、必需氨基酸分别提高106.09%、69.26%和79.17%;总黄酮提取率提高5.77%;纤维素酶和半纤维素酶的活力分别达到11.83和122.17U/g。同时,产品中还富含高活力的风味酶(β-葡萄糖苷酶),其活力为36.11U/g,该酶使产品的生物活性及香味得到了明显的改善。

多轮定向酶解木聚糖制备木低聚糖的研究

研究了多轮定向酶解未水解木聚糖的低聚糖组成、得率、适宜的用酶量及重复利用未水解底物的次数。结果表明 ,随着轮数的增加 ,木聚糖被降解的难度越来越大 ,而且木低聚糖的组成、平均聚合度也发生变化。采用逐步加大用酶量同时适当缩短酶解时间的方法 ,不仅能够获得较高的木低聚糖得率 ,而且可以改善酶解液的澄清度。但在实际生产中 ,重复利用未水解木聚糖的轮数应以 2～

生物制备功能性木低聚糖

以里氏木霉 (TrichodermareeseiRutC30 )为菌种 ,采用改进的Mandels配方能合成酶活力高达 2 5.5IU/mL的木聚糖酶 ,产酶周期 3d。在酶用量 1 % ,温度 50℃的条件下 ,酶解35g/L的纯木聚糖 4～ 1 0h ,可获得 74.0 8%～ 87.89%的低聚糖 ,此时低聚糖与木糖之比为1 6.76～ 1 2 .30。当用 55cm× 7.5cm的凝胶柱在进样量 60mL ,洗脱速度 80 0mL/h ,柱温为50℃的分离条件下 ,能较好地将聚糖与木低聚糖分开 ,总分离时间仅需 3h。

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析

通过设计特异性引物,以黑曲霉总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得了预期大小的基因片断。将目的基因使用pMD1 8-T载体转化到大肠杆菌,质粒PCR鉴定表明已成功克隆了黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因。测序结果表明,获得的目的基因片段大小为2 5 8 3 bp。该序列与GenBank中的β-葡萄糖苷酶基因序列相比,核苷酸序列同源性达9 8.8 8%、氨基酸序列同源性达9 9.7 7%。同时,通过PCR技术扩增,获得了去除信号肽的反应产物,大小为2 5 0 0 bp左右。该结果为目的基因在毕赤酵母中能够使用载体上的信号肽序列进行分泌表达奠定了基础。

利用银杏叶制备酵母饲料添加剂的优良菌筛选及其培养条件

通过比较不同酵母茵在以银杏叶为主要发酵原料中的增殖能力，获得了一株具有较强抗银杏叶抑制物的产阮假丝酵母。研究了培养条件对产阮假丝酵母增殖的影响，分析了在较佳培养条件下发酵产物中主要营养成分和活性成分的变化。结果表明，该菌株较适宜的增殖条件为，底物含水率为60％，料层厚度为2—4cm，最佳初始pH值为4．5—5．0，发酵温度为28—30℃。发酵后总黄酮含量略有下降，但每克产品中活性酵母细胞数达到40亿个，粗蛋白含量、总氨基酸、必需氨基酸分别提高了70．23％、40．77％和14．73％。

超滤法脱除木聚糖碱抽提液中氯化钠的研究

用切向流超滤法脱除木聚糖碱抽提液中所含的氯化钠。比较了截留分子量为１００００、５０００、１０００的改良纤维膜在相同条件下处理原料时的透过速率、盐的去除率、糖的截留率，选取了适宜的超滤膜。研究了操作压力、物料温度、进料浓度、进料速度对膜透过速率的影响，确定了用该膜超滤原料时的较佳的工艺参数。