猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白,采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫沉淀(IP)试验对其进行鉴定。【结果】成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N,获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达,大小约69 kD,经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带,经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL,获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000,可特异性识别pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白,且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】成功构建高效PDCoV-N原核表达系统,获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白,制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高,具有较强亲和力和特异性,可用于Western blotting、IFA和IP检测。

3株鸭腺病毒3型的分离鉴定与主要结构蛋白的生物信息学分析

旨在对鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)广东流行株进行分离,并预测分析六邻体(Hexon),五邻体(Penton),纤维蛋白(Fiber1、Fiber2)4个主要结构蛋白的理化性质、结构及功能。本研究用鸡肝癌细胞(LMH)对疑似DAdV-3感染的鸭、鹅肝脏组织进行病毒分离,对3株病毒分离株主要结构蛋白进行基因克隆、测序、拼接,获得4个蛋白的核苷酸序列后,使用MEGA 11软件进行氨基酸序列分析并构建遗传进化树,利用Expasy-ProtParam与SOPMA软件分析4个蛋白的理化性质与二级结构,应用AlphaFold2软件预测4个蛋白的三级结构,并对4个蛋白的线性B细胞抗原表位进行预测。结果:成功分离得到3株DAdV-3,命名为XZD-2021株、FRK-2021株、825-1-2021株;3株DAdV-3的4个蛋白均与GenBank中其他DAdV-3分离株处于同一分支中;Hexon蛋白更接近鹅腺病毒4型,Penton蛋白更接近D种禽腺病毒,Fiber1、Fiber2蛋白则更接近鸽腺病毒1型;4个蛋白均为酸性亲水蛋白,无信号肽,Hexon、Fiber1、Fiber2蛋白以自由卷曲为主,Penton蛋白则以α螺旋为主;三级结构预测结果与二级结构结果相符,线性B细胞抗原表位预测发现,Hexon蛋白的线性B细胞抗原表位最多,为11个,Penton蛋白与Fiber2蛋白为6个,Fiber1蛋白为5个,但Fiber1蛋白位于病毒表面的抗原表位最多,表位长度较Fiber2更长,且多位于负责与宿主细胞受体结合的头节区。综上,本研究成功分离得到3株DAdV-3,并对其4个主要结构蛋白进行了遗传演化、二级结构、三级结构等生物学特性进行分析,研究结果为后续DAdV-3致病特性和免疫特性研究奠定基础。

禽呼肠孤病毒检测方法研究进展

禽呼肠孤病毒(avian reovirus, ARV)主要引起家禽病毒性关节炎和免疫抑制,进而导致继发感染。近年来,随着ARV及其变异毒株的出现,加之传统疫苗对变异株的保护力不足,且没有特效药物治疗,使我国禽养殖业面临ARV感染的巨大风险。目前禽养殖场主要通过严格的生产管理结合周期性检测对禽呼肠孤病毒病进行防控。因此,本文着重介绍并分析了国内外已报道的ARV检测方法,为ARV的监测及新型诊断技术的研发提供依据,同时也为疫病的防控提供参考。