枸杞叶及枸杞多糖对去势雌性大鼠骨密度的影响

目的利用X射线小动物活体成像方法动态观察枸杞叶和枸杞多糖对去势雌性大鼠不同时间、不同部位骨密度的影响。方法 48只6月龄SD雌性未孕大鼠随机分为:假手术(Sham组)、去卵巢组(OVX组)和给药组,给药组再分为去卵巢+枸杞叶高剂量组(1000mg·kg-1)、低剂量组(500mg·kg-1)和枸杞多糖高剂量(100mg·kg-1)、低剂量组(50mg·kg-1)。采用去卵巢法造模,于造模4、8周后进行椎骨、股骨、胫骨骨密度测定;造模8周后,进行枸杞叶及枸杞多糖自由饮水给药干预,于给药6周和12周后进行椎骨、股骨、胫骨骨密度测定。结果大鼠去卵巢造模4周和8周后,OVX组和各给药组大鼠椎骨、股骨、胫骨骨密度均低于Sham组(P均<0.05),造模8周组大鼠椎骨、股骨、胫骨骨密度均低于4周组(P均<0.05)。给枸杞叶和枸杞多糖高、低剂量6周和12周后,OVX组、各给药组大鼠椎骨、股骨、胫骨骨密度均低于Sham组(P均<0.05);给药6周各给药组大鼠椎骨、股骨、胫骨骨密度与OVX组差异无统计学意义(P>0.05,给药12周给药组大鼠椎骨、股骨、胫骨骨密度高于OVX组(P<0.05)。结论大鼠去卵巢6周和12周后,其椎骨、股骨、胫骨均出现了骨质丢失,而服用枸杞叶及枸杞多糖后,可延缓去卵巢后的骨质丢失,且长时服用效果优于短时服用。

缺氧培养下NRF-1基因对大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响

目的通过建立NRF-1基因过表达及shRNA干扰大鼠心肌细胞系探究NRF-1基因在缺氧条件下对线粒体膜电位的影响。方法采用RT-PCR克隆大鼠心肌细胞中的NRF-1基因并将其连接至p CDHMCS-EF1-Puro慢病毒载体,以p CDH-MCS-EF1-Puro空质粒作为对照,同时设计并合成干扰慢病毒载体;将重组质粒与包装质粒一同转染293T细胞,收集病毒颗粒后感染H9c2细胞并通过嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株;在1%O2、5%CO2、94%N2条件下培养转染的细胞株48h,使用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测线粒体膜电位。结果获得NRF-1过表达细胞株、空载体细胞株及shRNA干扰细胞株;缺氧条件下三组细胞存活率均减弱,与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达组细胞活力较高,shRNA干扰组的细胞活力最弱;另外,流式细胞术检测线粒体膜电位发现缺氧培养后线粒体膜电位下降。与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达细胞株线粒体膜电位下降较轻,shRNA干扰细胞株线粒体膜电位下降最明显。结论说明大鼠心肌细胞通过NRF-1基因的过表达可以减缓由缺氧造成的线粒体膜电位的下降,提高细胞在缺氧条件下的存活能力。

细粒棘球蚴抗原Eg-01042的筛选、表达、纯化及免疫原性的初步研究

目的研究细粒棘球蚴中的原头蚴特异性抗原Eg-01042的表达、纯化及免疫原性。方法 1分析已经公开发表的细粒棘球绦虫转录组(mRNA)测序数据,筛选六钩蚴中不表达、只在原头蚴中高表达的抗原分子Eg-01042;2人工合成获得目的基因片段,经亚克隆、诱导表达、亲和层析法纯化重组蛋白rEg-01042,并对重组蛋白进行鉴定;3BALB/c小鼠随机分为3组:rEg-01042+佐剂免疫组、PBS+佐剂对照组和空白对照组,每组21只,分别于背部皮下注射10μg rEg-01042+PBS+佐剂、PBS+佐剂(均为100μL/只),空白对照组不处理,2周后加强免疫(均为100μl/只)。分别于免疫前、首次免疫后的1、2、3、4、5、6周取眼球采血,ELISA检测各时间点3组血清的rEg-01042特异性IgG水平及细胞因子IFN-γ及IL-4水平;4利用原头蚴感染小鼠血清、rEg-01042免疫小鼠血清和小鼠空白对照组血清经Western blot分析重组蛋白的免疫原性。结果 1成功筛选出原头蚴中高表达的抗原分子Eg-01042.;2成功表达、纯化出重组蛋白rEg-01042(为包涵体蛋白);3ELISA检测结果显示,自首次rEg-01042免疫后第2、3、4、5、6周重组蛋白rEg-01042产生的特异性IgG均高于PBS+佐剂组和空白对照组(P<0.01)。首次免疫后5周,IFN-γ及血清IL-4水平高于PBS+佐剂组和空白对照组(P<0.01)。4Western blot结果显示,原头蚴感染小鼠血清和rEg-01042+佐剂免疫组血清均能识别重组蛋白rEg-01042。结论获得细粒棘球蚴差异表达抗原Eg-01042并证实重组蛋白rEg-01042具有较好的免疫原性。

宁夏南部山区部分行政村居民人体成分水平与亚健康状况分析

目的了解宁夏南部山区农村居民人体成分的变化和亚健康率,为农村居民的健康指导提供理论依据。方法采用Inbody770型体成分分析仪,对宁夏南部山区(固原原州区、西吉县和海原县)农村居民进行人体组成成分测定,指标为Inbody评分、身体总水分(TBW)、细胞内水分(ICW)、细胞外水分(ECW)、蛋白质(Pro)、无机盐(IS)、瘦体重(FFM)、脂肪含量(BFM)、骨骼肌含量(SMM)、基础代谢率(BMR)、肌肉含量(SLM)、骨矿物质含量(BMC)等。结果不同性别和年龄组TBW、ICW、ECW、Pro、IS、BFM、SLM、FFM、SMM、BMC、BMR指标比较,差异均有统计学意义(P均<0.05),其中女性BFM随着年龄增加而增加,在50~59岁达到高峰后下降;男性BFM随着年龄增加而增加,在30~39岁达到高峰后下降。男性与女性的总体亚健康率分别为55.3%和50.6%,不同年龄组的女性亚健康率和总体亚健康率比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论人体成分指标的变化与性别和年龄有关,脂肪含量的变化趋势最为显著,处于亚健康状态的人群普遍存在。整体来看,宁夏南部山区农村居民健康状况有待改善。

2018年宁夏三县区农村居民包虫病感染现况及影响因素分析

目的了解宁夏三县区农村居民包虫病感染现况及影响因素。方法采用横断面研究的方法,对2018年宁夏三县区2888例农村居民采集血液并且检测血清中包虫特异性IgG抗体,结合相应的问卷调查资料,通过单因素和多因素方法分析当地农村居民包虫病感染现况及影响因素。结果宁夏三县区农村居民包虫病平均检出率为6.3%。单因素分析结果显示,不同性别、年龄、文化程度、职业、吃生菜程度、是否养狗的人群包虫病检出率不同(P均<0.05)。多因素分析结果显示,女性(OR=3.342,95%CI:2.243~4.981)和经常吃生菜(OR=2.020,95%CI:1.192~3.423)是该地区农村居民感染包虫病的危险因素,经常洗手(OR=0.354,95%CI:0.159~0.785)是该地区农村居民感染包虫病的保护因素。结论应该继续加强三县区人群包虫病的预防和控制,性别、不洁饮食和不洁卫生习惯是当地农村居民感染包虫病的主要影响因素。

缺氧对大鼠心肌细胞损伤的影响及机制

目的探讨缺氧对大鼠心肌细胞系H9C2的损伤及机制。方法在1%O_2+5%CO_2+94%N_2条件下培养大鼠心肌细胞株H9C2 3、6、12、24、48 h,并以正常大鼠心肌细胞株作对照,使用台盼蓝进行细胞计数;CCK-8法检测细胞存活率;实时监测心肌细胞生长状态;透射电镜观察细胞内部结构;活性氧检测试剂盒检测胞内活性氧(ROS);Western印迹法检测线粒体色素C蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞坏死程度。结果缺氧状态下,随着缺氧时间的不断增加,大鼠心肌细胞株H9C2的细胞生长、存活率均明显降低、细胞形态明显改变,细胞器结构明显损伤,ROS水平升高,线粒体细胞色素释放增加,细胞凋亡率明显增加,LDH的释放率明显增高。结论缺氧会造成大鼠心肌细胞的生长速度减慢、形态改变及心肌线粒体损伤,最终导致细胞凋亡和细胞坏死。

细粒棘球蚴特异性诊断抗原Eg-07279的制备及免疫原性研究

目的筛选出包虫病特异性诊断抗原分子并验证其免疫原性。方法对国家人类基因组南方研究中心公布的细粒棘球绦虫测序数据进行分析,利用生物信息学的方法筛选出六钩蚴中不表达且原头蚴中高表达的抗原分子Eg-07279,经重组克隆、表达后用亲和层析法纯化获得重组蛋白r Eg-07279;重组蛋白免疫小鼠检测其特异性IgG水平并使用Western blot验证其免疫原性。结果筛选出的抗原分子Eg-07279经克隆、表达、纯化获得重组蛋白。利用该重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测结果显示Eg-07279产生的特异性IgG水平(2.559±0.125)明显高于空白组(0.319 0±0.01),差异有统计学意义(P<0.01);Western blot检测结果显示原头蚴继发感染组和重组蛋白免疫组血清均可识别该重组蛋白而空白对照组鼠血清不能识别。结论获得细粒棘球蚴差异表达抗原Eg-07279并证实该重组蛋白具有较好的免疫原性,是较好的诊断抗原候选分子。

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析

目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体p ET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白r Eg-01883。ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射r Eg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10μg,100μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理。分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血。用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性Ig G抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白r Eg-01883的免疫原性。结果筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白r Eg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性Ig G抗体,免疫组小鼠的血清Ig G抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到最高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1±0.006)和空白对照组(0.241±0.01)(P<0.01)。首次免疫后6周,血清中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平,免疫组分别为43.23 pg/ml和24.88 pg/ml,均显著高于佐剂组(21.77 pg/ml,13.27 pg/ml)和空白对照组(17.40 pg/ml,12.25 pg/ml)(P<0.05)。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白r Eg-01883抗原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别。结论筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫ICR小鼠具有较好的免疫原性。

细粒棘球绦虫原头节抗原Eg-01883的B细胞表位预测、筛选及其血清学诊断价值

目的应用计算机软件分析细粒棘球绦虫原头节特异性抗原分子Eg-01883,预测其可能形成的B细胞表位,并探讨其B细胞表位的免疫反应性及诊断价值。方法使用在线软件SOPMA及DNAStar分析Eg-01883的二级结构,采用SWISS-Model预测该蛋白的三级结构。应用在线软件ABCPred和IEDB结合其亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原性等二级结构和三级结构对其B细胞表位进行分析预测、并人工合成表位肽段;以完整蛋白rEg-01883免疫小鼠产生的抗血清为一抗,采用间接ELISA方法筛选免疫反应性较强的表位,然后再以感染细粒棘球绦虫的小鼠血清为一抗,ELISA检测其免疫反应性,评价其诊断价值。结果初步筛选出7条抗原指数较高的Eg-01883表位,B细胞表位区域位于1-15、19-34、155-169、180-196、216-232、236-248、271-287位氨基酸。合成上述表位,纯度为99.99%。使用完整蛋白免疫血清筛选出2条反应原性较强的优势表位19-34和180-196,细粒棘球蚴感染小鼠血清能识别这两条B细胞表位,A450值结果分别为0.8218±0.0406和0.6398±0.0447,与对照组A_(450)值0.3312±0.0267和0.2961±0.0284比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论成功筛选到两个潜在的B细胞表位诊断抗原肽,对进一步开发细粒棘球绦虫早期诊断抗原和研究优势表位疫苗具有重要意义。

细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)诱导下差异表达microRNA的筛选及分析

目的对细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)诱导小鼠差异表达的microRNA进行筛选和分析,以期为rEg.P29免疫前后宿主免疫细胞的分化研究提供线索。方法将6-8周龄SPF级BALB/c小鼠随机分为2组,rEg.P29免疫组和对照组,每组12只。rEg.P29免疫组于小鼠腹部多点免疫重组蛋白100μl(含rEg.P2910μg),共免疫2次,第1次免疫2周后进行第2次免疫。提取第2周(第1次免疫后2周)、第6周(第1次免疫后4周)、第8周(第1次免疫后6周)各组小鼠外周血淋巴细胞,分离microRNA用于建库测序,利用生物信息学方法筛选rEg.P29诱导下差异表达的microRNA分子,并进行注释分析。结果测序所得数据经拼接组装比对,共获得成熟的microRNA序列342条,其中已知的microRNA序列206条,未知信息序列36条。在已知的microRNA分子中,差异表达共55个,其中上调31个,下调24个;在新发现的microRNA分子中,差异表达11个,其中上调5个,下调6个。靶基因预测结果显示,表达上调microRNA调控的靶基因有14279个,表达下调microRNA调控的靶基因13911个。GO富集注释结果显示,在上调分子中,生物学进程(BP)获得18条注释信息,其中16个microRNA调控的826个靶基因被注释到细胞分化(cell differentiation)条目下;在下调分子中,生物学进程(BP)获得21条注释信息,其中25个microRNA调控的712个靶基因被注释到细胞分化(cell differentiation)条目下。KEGG通路分析结果显示,无论是表达上调还是下调的分子,其靶基因的代谢通路均显著富集到Th1 and Th2 cell differentiation、Th17 cell differentiation、B cell receptor signaling pathway等与细胞分化相关的信号通路以及与肿瘤相关的信号通路上。结论在rEg.P29诱导下小鼠免疫细胞存在差异表达的microRNA分子,这些分子可能与免疫细胞的分化相关。

包虫病诊断抗原分子Eg-00512的筛选、重组表达及抗原性鉴定

目的筛选细粒棘球绦虫原头蚴抗原分子Eg-00512,并进行重组表达、纯化及免疫特性鉴定,以期作为棘球蚴病特异性诊断抗原。方法对国家人类基因组南方研究中心(CHGCS)发表的细粒棘球绦虫4个不同发育阶段的表达谱数据进行差异比较分析,筛选仅在原头蚴阶段特异表达的基因Eg-00512;利用DNAStar软件包对其编码蛋白Eg-00512进行抗原表位分析;选取合适的序列片段作为目的片段,构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经诱导表达、纯化获得重组蛋白rEg-00512。将BALB/c小鼠随机分为免疫组、佐剂对照组、PBS对照组,分别经皮下多点注射重组蛋白、PBS+弗氏佐剂和PBS,2周后加强免疫一次。分别于免疫前,第一次免疫后2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后5周摘眼球法采血,采用ELISA检测各时间点血清中特异性IgG抗体水平变化;以该血清为一抗,采用Western blot分析重组蛋白的免疫反应性。结果筛选出仅在细粒棘球蚴原头蚴阶段高表达的Eg-00512基因。该基因编码203个氨基酸,分子质量单位为23ku,其抗原表位主要位于1-15、55-93、111-119、126-149、166-194和199-202氨基酸残基及其附近。成功构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经IPTG诱导表达重组蛋白rEg-00512。重组蛋白rEg-00512纯化后免疫小鼠诱导产生特异性IgG抗体,其中免疫5周时抗体达最高水平A450值为1.807±0.767,与佐剂对照组0.111±0.014和PBS对照组0.132±0.0246比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot显示,该重组抗原可被免疫鼠抗血清及细粒棘球蚴原头蚴感染鼠血清识别,而不与正常小鼠血清反应。结论成功筛选并获得重组蛋白rEg-00512,该蛋白具有较好的抗原性,可作为棘球蚴病免疫诊断候选抗原。

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-08002的克隆、表达及免疫反应性分析

目的筛选细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头节抗原分子,并进行克隆、表达及免疫反应性分析。方法在对细粒棘球绦虫六钩蚴和原头节阶段表达的转录组测序数据进行差异分析的基础上,筛选出原头节阶段特异性表达的抗原分子。PCR扩增后克隆至p ET28a载体,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白rEg-08002,快速免染聚丙烯酰胺电泳分析表达产物;蛋白质印迹(Western blotting)分析rEg-08002的免疫反应性。ELISA分析重组蛋白rEg-08002与细粒棘球蚴病患者血清和健康人血清的免疫反应性。结果筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,大小为612 bp,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002。快速免染聚丙烯酰胺电泳和Western blotting分析结果显示重组蛋白rEg-08002在E.coli JM109中获得高效表达,在相对分子质量(Mr)约为23 000处可见重组蛋白rEg-08002条带,主要以包涵体形式存在,r Eg-08002可被感染棘球蚴的小鼠血清识别。ELISA分析结果表明,12份细粒棘球蚴病患者血清和12份健康人血清的平均吸光度(A450)值分别为1.245±0.265和0.469±0.006,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,获得的重组蛋白rEg-08002具有较好的免疫反应性。

细粒棘球绦虫原头节抗原Eg-00512的生物信息学分析

目的分析细粒棘球绦虫原头节特异性抗原Eg-00512的生物信息学特征。方法通过NCBI数据库获取Eg-00512蛋白的氨基酸序列;使用ProtParam在线软件分析Eg-00512蛋白的理化性质;采用SOMPA在线软件分析蛋白的二级结构;使用IEDB在线软件预测Eg-00512蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性、β-转角;应用SWISS-MODEL在线服务器分析蛋白氨基酸序列并组合模板和Eg-00512蛋白的三级结构;B细胞表位采用在线软件IEDB及BcePred综合预测,T细胞表位采用在线预测软件SYFPEITHI分析确定。结果Eg-00512蛋白由1254个氨基酸组成,理论pI值6.15;归类于稳定蛋白质,属于亲水性蛋白。Eg-00512蛋白的二级结构中α螺旋占51.28%,延伸链占17.22%,β-转角占4.78%,无规卷曲占26.71%。Eg-00512蛋白B细胞表位数量各为8个;有13个CTL和14个Th细胞优势表位。结论生物信息学方法预测细粒棘球绦虫原头节含有多个优势B、T细胞抗原表位,为包虫病的诊断和疫苗的研究奠定了理论基础。

重组抗原P29免疫小鼠感染细粒棘球蚴后mRNA表达差异分析

目的对重组蛋白P29免疫并感染细粒棘球蚴的小鼠产生差异表达的mRNA进行分析,为重组蛋白P29分子的转化和应用研究奠定基础。方法将BALB/c小鼠随机分为3组,分别为P29免疫+感染组、感染对照组和空白对照组。P29免疫+感染组小鼠用10μg/只重组蛋白P29进行皮下多点免疫,并在3个月后用细粒棘球蚴腹腔感染小鼠,感染对照组只感染细粒棘球蚴,空白对照组不免疫P29蛋白也不感染细粒棘球蚴。在不同时间点制备外周血淋巴细胞,提取出总RNA,再利用KAPA Strand mRNA-Seq试剂盒进行mRNA建库,利用二代测序技术测序后采用生物信息学方法分析转录组表达差异并对其进行功能和通路注释。结果利用mRNA文库测序P29免疫+感染组免疫后获得19 717 433条reads, P29免疫+感染组感染后获得24 908 555条reads,空白对照组免疫后获得25 555 287条reads,空白对照组感染后获得23 772 436条reads,感染对照组感染后获得21 539 925条reads。各文库测序量均在4Gb以上。通过生物信息学分析筛选出疫苗诱导组差异表达mRNA共473个,病原体感染组差异表达mRNA共85个,疫苗诱导+病原体感染差异表达mRNA共192个。通过GO富集分析,免疫后的P29免疫+感染组与空白对照组比较,差异表达的mRNA主要富集在蛋白二聚体活动,高尔基体及翻译等过程中;感染后的感染对照组与空白对照组比较,差异表达的mRNA主要富集在转录因子活动细胞质,免疫反应等过程;免疫感染后的P29免疫+感染组与感染对照组比较,差异表达的mRNA主要富集在蛋白二聚体活动,质膜,细胞运动等过程。KEGG通路分析中差异表达的mRNA主要富集在核糖体,趋化因子信号通路,紧密连接等通路。结论重组抗原P29免疫小鼠攻击感染细粒棘球蚴后存在mRNA的差异表达,这些分子与多种生物学过程密切相关。