胸腺素α_1-硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

胸腺素α1(thymosinalpha 1,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛。为了大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成Tα1基因 ,克隆于 pUC19的EcoRI和PstI位点 ,经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入 pThioHisA的EcoRI和PstI位点 ,转化大肠杆菌TOP10菌种 ,酶切鉴定证明正确后 ,经 1mmol/LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,并经Westernblot分析证实。用离子交换柱层析可纯化出硫氧还蛋白与Tα1④的融合蛋白 ,利用3H -TdR掺入法证实 ,该融合蛋白具有刺激小鼠脾淋巴细胞的活性。

MEDLINE光盘及检索

MEDLINE光盘是光盘数据库中的佼佼者,是医学界倍受欢迎的医学情报特使。目前在我国引进的出自两个公司。即银盘(SilverPlatter)和剑桥(Cambridge)的MEDLINE产品。下面主要以Silver Platter公司的MEDLINE光盘为主,根据我们的实践和认识。

针对bcl─2RNA核酶体外切割反应的琼脂糖凝胶电泳

目的：用琼脂糖凝胶电泳检测体外ｂｃｌ┐２ｃＤＮＡ和ＲＺＤＮＡ转录物与鉴定核酸的体外切割活性．方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳．结果：琼脂糖凝胶电泳可见核酶和ｂｃｌ－２ＲＮＡ转录物及其切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ后的产物．

切割bcl－2mRNA核酶诱导HL－60细胞凋亡的形态学研究

切割ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ核酶诱导ＨＬ－６０细胞凋亡的形态学研究赵永同，朱峰，金明，王刚，王成济（第四军医大学生物化学教研室西安７１００３３）关键词核糖核酸，凋亡，ｂｃｌ－２中图号Ｑ５２２；Ｑ７８１核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅ，ＲＺ）是一类具有酶活性的ＲＮＡ分...

切割bcl─2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的：构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应．ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中．结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ基因已被克隆于ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点，重组逆转录病毒载体命名为ｐＤＲＺ－ＲＺ．结论：体外合成ＲＺ基因后，可定向克隆逆转录病毒载体。

凋亡的分子机理

细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）是细胞接受某种信号后或受到某些因素刺激后一种主动的，由一些凋亡相关基因相互作用的细胞消亡过程，影响凋亡的基因可分为两类，即促进凋亡的基因和抗凋亡的基因。本文简述了这些基因与凋亡的关系，重点论述了ｂｃｌ－２家族与凋亡的研究进展。

核酶对bcl－2mRNA的体外切割

通过微机对ｂｃｌ－２ＲＮＡ二级结构的分析，设计针对ｂｃｌ－２片段５＇ＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＵＣＧＣＣＡＧＧＡＣＣＵＣＧ３＇的“锤头状”（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ，ＲＤ）基因，平端连接于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）ＨｉｎｃⅡ位点，克隆后经测序表明序列正确，ｂｃｌ－２和Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因经体外转录，５０℃作用２ｈ，从１６５６－１６５７（Ｃ－Ｇ）位之间切断ｂｃｌ－２ＲＮＡ片段．

口服硒拮抗镉对大鼠睾丸组织的损伤

作者在光镜下检查了雄性大鼠给镉(Cd)和(或)硒(Se)后睾丸、肝、肾和心脏的形态学改变;同时(?)Zeeman效应石墨炉法和原子荧光法分别测定了饮水、饲料和全血Cd和Se的含量。结果表明:给Cd后大鼠睾丸组织萎缩,生精细胞数目减少和坏死;肾/体比值从空白对照(C)组的0.74±0.03增至实验(E2)组的0.83±0.03(P<0.01);心/体比值从C组的0.36±0.04增至E2组的0.41±0.02,P<0.01;Cd在血液中的蓄积增加,从C组的2.3±1.5mg/kg增至E2组的167.5±33.8mg/kg(P<0.01)。这些形态学的改变和给Cd剂量有关。经口补充小剂量Se(0.05 mg kg)可拮抗Cd所致的睾丸损伤及脏/体比值的异常。

抗bcl-2核酶在HL-60细胞内的表达

设计并合成针对bcl-2 mRNA的“锤头型”(hammerhead)核酶基因,克隆后经测序表明序列正确。bcl-2和RZ基因经体外转录和切割实验后,表现出很强的切割活性,然后把RZ基因定向克隆于真核表达载体pDOR-neo,重组体被命名为pDOR-RZ。通过脂质体(lipofectin)介导的DNA转染法,成功地把pDOR-RZ导入HL-60细胞。用Southern印迹杂交、RNA斑点杂交和流式细胞仪(FCM),观察RZ基因在HL-60细胞内的表达。结果表明:(1)RZ在转染HL-60细胞后72小时得以表达;(2)由于RZ的表达,细胞内Bcl-2蛋白合成受到抑制;(3)在FCM图谱上可见到明显的凋亡峰。

硒对大鼠镉中毒拮抗作用的某些病理学观察

硒是人体必需的微量元素,是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的组成成分。研究环境化学因素对健康的影响,不仅要注意单个元素的作用,同时要注意各个元素之间的相互作用。胃肠外给动物硒可以保护镉所致的睾丸损害。但经口摄入镉和硒,更接近人类正常暴露环境污染物的情况。本实验经口给大鼠镉并补充小剂量的硒,观察镉的毒作用及硒的保护作用。

光盘的工作原理及类型

简述光盘工作原理，对各个类型已实用和处于研制阶段的光盘作了较详细的介绍。

凋亡相关基因的研究进展

细胞凋亡(apoptosis)是细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后一种主动的由基因调控的细胞消亡过程。凋亡与坏死不同,其发生具有积极的生物学意义,是维持机体内环境稳定所必需的。细胞凋亡与有丝分裂相互协调,共同调控胚胎发育、器官的发育与退化、免疫、造血等生理过程。在肿瘤的发生与消退、化疗、放疗中,凋亡也起着重要作用,因而对凋亡的研究,尤其是调亡的分子调控的研究倍受人们的重视。 形态学上,凋亡的细胞体积缩小。

胸腺素α_1 基因的克隆表达及其生物活性

胸腺素α1(thymosinalpha 1 ,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛 .为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成Tα1基因 ,克隆于质粒pUC1 9的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入pThioHisA的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .转化大肠杆菌T0P1 0 ,酶切鉴定正确后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,用离子交换层析纯化融合蛋白 .溴化氰裂解融合蛋白 ,释放出Tα1单体 ,经离子交换色谱纯化出Tα1.采用3 H TdR参入法进行生物活性测定 ,证实融合蛋白和Tα1均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 .

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽

目的 研究 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)显示小分子多肽的方法 .方法 观察不同方法处理的样品 ,上样量对电泳结果的影响及对分子量标准 (Mr 2 5 12～ 16 949)进行直线回归分析 .结果 样品的不同处理条件未见有差异 ;在该实验系统条件下上样样品为每孔 5～ 10μg较佳 ;分子量标准直线回归系数 r=- 0 .96 2 .结论 样品处理方便 ;上样量少 ;在 16 0 g· L- 1 T,6 0 g· kg- 1 C较低的丙烯酰胺含 6 mol· L- 1脲的分离胶中能够显示 Mr为 2 5 12的多肽 。

应用SDS-PAGE显示小分子多肽技术的探讨

为探讨显示小分子多肽技术 ,应用SDS PAGE寻找更简单、快捷的分析小分子多肽的方法。采用 8%T ,3%C的丙烯酰胺浓缩胶和含 6mol/L脲 (或含 2 4 %的甘油 )的 16%T ,6%C的丙烯酰胺分离胶的双层不连续SDS PAGE和三羟基甘氨酸电泳缓冲液显示蛋白分子量标准 ( 2 512～16 94 9kD)和待测样品 ,并对蛋白分子量标准在这两种分离胶中进行了回归分析。结果表明在这两种条件下均能显示分子量小至 2 512kD的多肽 ;多肽样品在含脲和在含甘油的 2L T SDS PAGE中均有较好的显带 ;蛋白分子量标准的直线回归系数分别为r =- 0 966和r =- 0 964。它们是显示小分子多肽和估测其相对分子质量及对多肽分子进行进一步分析的更为简便易行的方法。

bcl-2核酶(Ribozyme)促进紫杉醇诱导的细胞凋亡

用核酶技术阻断或降低抗凋亡蛋白 Bcl- 2的表达以促进化疗药物紫杉醇诱导的食管癌细胞凋亡 ,探索克服耐药、提高紫杉醇疗效的新途径 .将特异性切割 Bcl- 2 m RNA的核酶克隆至含MTII启动子并可为 Zn SO4 诱导表达的真核表达载体中 ,通过脂质体转入食管癌鳞状上皮细胞系Eca 1 0 9中 ,经 G41 8筛选得到稳定抗性细胞株 X1 0 9R,挑取单细胞株扩大培养 ,1 40μmol/L Zn SO4诱导 3d,用 Northern- blot、免疫荧光、流式细胞仪鉴定核酶及 Bcl- 2蛋白表达情况 ,用 TUNEL标记及流式细胞术检测凋亡细胞的比例 .bcl- 2核酶在不同单细胞株中有不同程度的表达 ,其中一株X1 0 9R1 4表达最高 .测定其中 Bcl- 2蛋白含量 ,发现 Bcl- 2蛋白表达大为降低 .加入紫杉醇后 ,TUNEL标记及凋亡峰测定结果都表明同一条件下凋亡率升高 .结果提示 ,转入特异性切割 bcl- 2m RNA的核酶可有效地阻断 Bcl- 2蛋白合成 .Bcl- 2蛋白表达降低可明显促进紫杉醇诱导的细胞凋亡 .说明 Bcl-

EPO模拟肽基因4串联体的构建和表达

目的 克隆和表达 EPO模拟肽基因 4串联体 .方法 设计了特殊的基因串联方案 ,在人工合成 EPO模拟肽全基因的基础上 ,将 EPO模拟肽基因由单体逐步地连接成 4串联体 .继而将获得的正确 EPO模拟肽 4串联体插入 p BV2 2 0表达载体诱导表达 .结果 构建的 EPO模拟肽基因 4串联体经酶切和 DNA测序分析 ,结果表明该基因串联体的序列与设计的序列完全相同 .EPO模拟肽 4串联体插入 p BV2 2 0载体后 ,重组菌经 42℃诱导 4h,SDS- PAGE分析结果显示 ,该串联体得到较高水平的表达 .凝胶扫描结果表明 ,其表达量约占菌体蛋白总量的 2 0 % .结论 EPO模拟肽基因

重组胸腺素α_1的分离纯化和活性测定

目的 利用融合表达载体 p Thio His A的重组质粒p Thio His A- Tα1 4,转化大肠杆菌 TOP10得到的工程菌 ,来分离纯化表达的胸腺素 α1 (thym osin alpha1,Tα1 ) .方法 将高效表达融合蛋白的工程菌用细胞破碎器裂解 ,经 80℃热处理 ,离心上清采用 Q- Sepharose FF阴离子交换色谱纯化融合蛋白 .融合蛋白经 CNBr裂解后用常压离子交换色谱纯化Tα1 单体 .应用 SDS- PAGE,2 L - Tricine- SDS- PAGE和 HPL C进行鉴定 .结果 SDS- PAGE分析表明菌体表达的融合蛋白占菌体总蛋白的 40 0 g· kg- 1 .经 2 L - Tricine- SDS- PAGE分析证实 ,融合蛋白可裂解出 Tα1 单体 ,裂解物经简单的离子色谱可以纯化出 Tα1 单体 ,HPL C鉴定纯化出的 Tα1 纯度可达95 0 g· kg- 1以上 .利用 3H- Td R进行的生物活性测定表明 ,在致有丝分裂原 Con A存在的条件下 ,融合蛋白和 Tα1 单体均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 ,与化学合成的Tα1 相比具有相似的生物活性 .结论 该方法是分离纯化Tα1 简便易行 ,经济有效的方法 ;同时也为 Tα1

重组胸腺素α1的纯化及活性

将胸腺素α1基因 4串体克隆于 pThioHisA融合表达载体 (pThioHisA Tα1④ ) ,转化大肠杆菌TOP10。在IPTG诱导下 ,融合蛋白得到了高效表达。SDS PAGE分析确定诱导表达的融合蛋白占菌体总蛋白的 40 % ,且表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。把用离子交换层析纯化出的目的蛋白进行CNBr化学裂解 ,经简单的离子交换层析可纯化出胸腺素α1单体 ,HPLC鉴定胸腺素α1的纯度达 98%。利用3 H TdR进行生物活性测定 ,证实融合蛋白和胸腺素α1单体均具有在致有丝分裂原ConA存在的条件下 ,刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力 ,与化学合成的胸腺素α1相比具有相似的生物活性。

切割bcl-2mRNA核酶诱导人胆管癌细胞凋亡的形态学改变

目的 研究切割 bcl- 2 m RNA核酶诱导人胆管癌细胞凋亡的形态学改变 .方法 将合成的切割 bcl- 2 m RNA核酶基因与真核细胞表达载体重组 ,并用重组后的载体转染人胆管癌细胞 ,通过光镜及扫描和透射电镜手段 ,观察转染后的胆管癌细胞凋亡的形态学改变 .结果 转染切割 bcl- 2 m R-NA核酶基因的胆管癌细胞出现较典型的凋亡形态学改变 .结论 该切割 bcl- 2 m RNA核酶能明显降低胆管癌细胞内bcl-