肿瘤特异性凋亡基因对荷瘤小鼠基因治疗的实验研究

随着分子生物学研究的不断深入和人类基因组计划的完成, 人类正在进入基因诊断和基因治疗的时代, 特别是恶性肿瘤的基因诊断和基因治疗日益受到人们的重视.肿瘤的基因治疗虽然不能替代手术、化疗和放疗, 但其可能对提高化疗、放疗的敏感性, 减少肿瘤术后复发和转移具有一定的作用.近年研究发现, 鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV)VP3基因编码的一种蛋白质, 可通过独立于p53作用途径、不被Bcl-2抑制的方式, 诱导人肿瘤细胞或转化细胞凋亡, 而对人正常细胞没有毒性作用, 故称之为肿瘤特异性凋亡因子, 鉴于其独特诱导凋亡的作用, 有望成为一种有效的抗肿瘤药物[1,2].我们在克隆和构建了VP3基因真核表达载体的基础上, 进一步研究了其在肿瘤基因治疗中的作用.

CRISPRi在体抑制肝脏miR-122的表达

目的:探索CRISPR干扰(CRISPR interference,C R I S P R i)能否实现在体抑制肝脏m i R-122表达.方法:针对m i R-1 2 2启动子区设计sg RNA(sg T1和sg T2),并分别将其与无DNA切割活性仅保留识别活性的d Cas9-KRAB载体通过尾静脉流体力学法注射到8-10 wk龄小鼠,注射1、2、4 wk后通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)方法检测肝脏mmu-mi R-122的表达;设计不同的sg RNA浓度梯度,探索CRISPRi在体抑制肝脏mi R-122表达是否存在剂量依赖性;通过q RT-PCR及Western blot方法检测肝脏mi R-122靶分子HOMX1和Cyclin G1的表达变化.结果:在注射1 wk和2 wk后,sg T1介导的C R I S P R i在体抑制肝脏m i R-122的表达水平分别为23%(P<0.05)和16%(P<0.05);随sg RNA的剂量升高,肝脏mi R-122表达降低,当lenti Guide-Puro-sg T1质粒为120?g时,可将mi R-122的表达抑制约30%;CRIPSRi在体抑制肝脏mi R-122表达的同时,上调了mi R-122下游靶分子HMOX1和Cyclin G1的表达.结论:本研究利用CRISPRi实现了在体抑制肝脏mi R-122的表达,为抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)的在体治疗提供了新的策略.

检测肾综合征出血热病毒抗体的自身血凝试验的建立

目的 建立一种快速检测肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）虱血液中病毒抗体的自身血凝试验方法。方法 采用木瓜酶消化法制备红细胞糖蛋白单克隆抗体（ｍｃＡｂ）的Ｆ（ａｂ）２片段，用硫酸鱼精蛋白提取ＨＦＲＳ病毒抗原，并用戊二醛法将两种蛋白偶联关双价试剂，以ＨＦＲＳ虱阳性血清与人“Ｏ”型血红细胞模拟全血标本。进行红细胞凝集试验。结果 抗红细胞ｍｃＡｂＦ（ａｂ）２片段与ＨＦＲＳ病毒抗原蛋白发生有效偶联。

光敏生物素标记流行性出血热病毒R22株M片段cDNA探针的研究

应用光敏生物素标记我国流行性出血热病毒R22株M片段R3克隆cDNA,制备出生物素化的cNNA探针。用此探针与流行性出血热病毒R22株和陈株进行斑点杂交,结果R3克隆与R22株和陈株均出现阳性杂交信号,而与单纯疱疹病毒、柯萨奇B组病毒和正常对照细胞组的杂交结果均为阴性。光敏生物素标记探针可检出10pg的cDNA,并用此方法检测TEHF病毒在感染乳鼠体内的分布情况。

核酸杂交反应中影响因素分析

以光敏生物素标记的R3 cDNA克隆为模型,采用正交设计的方法,对影响核酸杂交反应的主要因素:杂交反应温度,反应时间,探针浓度及甲酰胺浓度作了综合性分析。当探针浓度为800μg/L,甲酰胺浓度为10mol/L,50℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度(10pg)。

高+Gz值暴露对胃黏膜损伤的防治性研究

目的研究+Gz(headward gradinet acceleration,+Gz,即走加迷度)值暴露大鼠胃黏膜及外周血胃泌素(gastrin,GAS)、生长抑素(somatostatin,SS)的变化,探讨高+Gz值暴露后大鼠急性胃黏膜病变(acute gasticmucosal lesion,AGML)可能发生的机制。方法 50只SD成年雄性大鼠随机分成5组:A组为正常对照组,B组为加味丹参饮组,C组为适应性训练组,D组为奥美拉唑组,E组为损伤组,B、C、D三组相应干预后及E组在高+Gz值暴露5min,观察各组胃黏膜损伤的程度。各组组织标本经光镜观察组织形态学改变,并用ELISA方法检测血液中SS和GAS含量的变化。结果 E组大鼠胃窦充血、炎症改变明显,C组胃黏膜轻度炎症改变、无明显出血,B、D组组织无明显损伤;C组组织间质可见急慢性炎细胞浸润。GAS含量干预组比损伤组和对照组降低(P<0.05),SS含量干预组和E组比对照组增高(P<0.05)。结论高+Gz值暴露大鼠AGML的发生与血液中GAS、SS含量的改变及胃酸、胃蛋白酶分泌异常,导致胃黏膜屏障破坏有关。

生长抑素临床应用研究进展

生长抑素是一种典型的脑肠肽,广泛分布于全身及胃肠道各组织器官中,具有抑制生长激素分泌,抑制胃酸、胃蛋白酶释放的功能,能减少内脏血流,并能减少胰腺的内、外分泌以及胃小肠和胆囊的分泌,对胰腺细胞具有保护作用的多肽类激素。本文就SS及其在临床应用的研究现状作一综述。

重组人IL-18对辐射损伤后小鼠造血系统的影响

为探讨重组人白介素-18(IL-18)对辐射损伤后小鼠造血系统的影响,对32只小鼠分4组进行对比观察。结果表明,重组人IL-18对辐射损伤后小鼠的骨髓细胞、外周血细胞均有明显的恢复作用,与单纯辐射损伤组相比差异有显著意义。结论:重组人IL-18对辐射后小鼠造血系统的损伤有促进恢复的作用。

豌豆落花落荚、花芽分化及栽培技术

“八五”期间，对豌豆的落花落荚、花芽分化及栽培技术进行了研究，结果表明，影响豌豆落花落荚的主要原因是品种、栽培技术和不利的气象因子；豌豆的花芽分化期为六期，花芽分化的进程、所需的有效积温，不同品种间则有较大的差异；豌豆栽培技术主要有合理施肥、适宜密植、选用良种、适期播种和加强田管。

rhIL-18对放疗前后肿瘤患者PBMC功能的调节作用

为探讨rhIL-18对放疗前后肿瘤患者周围血单个核细胞(PBMC)免疫功能的调节作用,分离65例放疗前后肿瘤患者及40例正常人的外周血PBMC,在不同浓度rhIL-18刺激下培养72h,收集其培养上清液,采用ELISA方法检测其中IL-2、IL-4、IFN-γ和GM-CSF的含量。结果表明,PHA单独刺激下肿瘤放疗组IL-2、IFN-γ和GM-CSF的含量比正常对照组显著降低,其差异具有显著性P<0.05;PHA联合不同浓度的rhIL-18刺激下,放疗前后肿瘤组的IL-2、IFN-γ和GM-CSF的含量均高于PHA组,其差异具有显著性(P<0.01),但与正常对照组没有显著性(P>0.05);PBMC培养上清液中IL-2、IFN-γ和GM-CSF的水平在放疗前后肿瘤组中随着IL-18浓度的增加呈现出增强的趋势;但各组IL-4含量变化不明显。结论:IL-18能够促进放疗前后肿瘤患者PBMC产生IL-2、IFN-γ和GM-CSF,因此在调节免疫功能和增强机体抗肿瘤方面具有一定意义。

适合于人体治疗的人源化单克隆抗体

应用基因工程技术对鼠单克隆抗体进行改造,使其人源化,即将鼠单克隆抗体的CDRs 区插到人抗体V 区框架中。其目的在于降低鼠单克隆抗体对人体的抗原性,以适合于人体治疗。实验证明:这种人源化的单克隆抗体的抗原性大大降低,而其抗体活性仍存在,有的人源化抗体甚至出现了原抗体不曾具有的ADCC 效应,将人源化单克隆抗体用于人体治疗,获得满意的疗效,本文将对此进行综述。

重组人IL-18对核辐射损伤小鼠脾细胞因子的影响

为了探讨重组人IL-18(rhIL-18)对核辐射损伤后小鼠脾细胞因子的免疫调节作用,对32只C57小鼠分4组进行核辐射损伤,2周后取小鼠脾淋巴细胞体外培养,用试剂盒测定其培养上清中IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4和脾细胞抗体形成量,观察rhIL-18对核辐射损伤小鼠脾细胞因子的免疫调节作用。结果表明与对照组比较,rhIL-18能够提高核辐射损伤前后小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、GM-CSF和IL-2的能力,辐射损伤后应用rhIL-18组的细胞因子水平高于核辐射损伤前应用rhIL-18组;但对IL-4分泌能力和脾细胞抗体形成量没有影响。结论:rhIL-18具有促进核辐射损伤小鼠脾细胞分泌IL-2、IFN-γ和GM-CSF的作用。

Apoptin基因壳聚糖缓释微球载体的制备及其对A375细胞的凋亡诱导作用

为制备以羧甲基壳聚糖为基质材料的apoptin基因缓释微球载体，并研究其对A375细胞的凋亡诱导作用，采用超声波法制备羧甲基壳聚糖-DNA微球载体，并用扫描电镜对其进行了表征观察，然后将羧甲基壳聚糖-apoptin DNA微球转染人黑素瘤细胞A375，并通过RT-PCR、MTT和凋亡细胞DNA提取等方法对细胞的转染情况及细胞凋亡作了体外检测。结果表明，携带apoptin基因的羧甲基壳聚糖微球直径为200-300nm，成球性较好；此apoptin微球载体能有效地转染A375细胞，诱导A375细胞发生凋亡，从而抑制瘤细胞生长。

用肾综合征出血热病毒结构蛋白体外免疫正常人外周血淋巴细胞制备单克隆抗体

用亲和层析提取的肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）结构蛋白（５０ｋＤ和６７ｋＤ）为抗原，在体外免疫正常人外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）。ＰＢＬ经亮氨酸甲基酯处理后，在含有ｓＰＷＭ－Ｔ、ＩＬ－２及不同浓度抗原的培养基中培养６ｄ，计数存活ＰＢＬ数量。结果表明，在上述体外免疫条件下存活ＰＢＬ的数量与抗原剂量呈正相关。将此体外免疫的ＰＢＬ与人－鼠杂交瘤细胞（Ｋ６Ｈ６／Ｂ５）融合，获得了３株分泌抗ＨＦＲＳＶ人单抗的杂交瘤细胞，表明在体外免疫条件下，正常人ＰＢＬ能够对ＨＦＲＳＶ结构蛋白发生特异性免疫应答。

rhIL-18对核辐射诱导小鼠脾细胞凋亡的抑制机制研究

为了探讨重组人白细胞介素18(rhIL-18)对核辐射所致小鼠脾细胞凋亡的抑制作用机制,对32只C57小鼠分4组进行核辐射损伤,2周后取小鼠脾淋巴细胞体外培养,用细胞凋亡ELISA试剂盒测定胞质中核小体含量,用DNA琼脂糖电泳检测凋亡细胞DNA片段;用原位杂交方法测定脾细胞凋亡相关基因bax与bcl-2的表达,观察rhIL-18对其表达的调节作用。结果表明,与对照组比较,rhIL-18能够明显降低核辐射所致的小鼠脾细胞凋亡;促进bcl-2的表达,下调bax基因的表达。结论:rhIL-18可能通过促进bcl-2的表达、下调bax基因的表达方式抑制核辐射诱导的小鼠脾细胞凋亡。

构建SARS病毒E2蛋白保护性抗原原核表达载体

目的 构建SARS病毒E2蛋白保护性抗原片段的原核表达载体 ,为SARS的诊断和预防奠定基础。方法 采用人工合成法合成SARS病毒E2蛋白 3’端cDNA ;采用常规分子克隆方法将此cDNA片段克隆入原核表达载体 pBV2 2 0中 ,经温度诱导和SDS -PAGE电泳证明外源蛋白表达。 结果 合成的E2蛋白cDNA经序列测定表明 ,与报道的SARS病毒相应序列一致 ,内切酶酶切及PCR均得到 4 5 6bp的cDNA片段 ,与实验设计一致 ,证明该cDNA片段插入了 pBV2 2 0载体中 ;SDS -PAGE电泳表明有外源蛋白表达。

rhIL-18对辐照小鼠免疫功能的调节作用

目的研究重组人白细胞介素18(rhIL-18)对辐照小鼠免疫功能的调节作用,探讨rhIL-18在辐照防护中的应用价值。方法将32只小鼠随机分为正常对照组、单纯辐射照射组、rhIL-18+辐射照射组、辐射照射+rhIL-18组,辐照剂量为60Coγ射线4.0Gy,rhIL-18为0.6mg腹腔注射,处理后分别用淋巴细胞转化实验、NK细胞毒实验、T淋巴细胞亚群检测,测定小鼠脾细胞体外培养上清中白细胞介素-2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)、单核巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和血清中IgG的含量,观察rhIL-18对其免疫功能的调节作用。结果与单纯辐射照射组比较,rhIL-18能提高辐照后小鼠的T、B淋巴细胞转化能力(P<0.05),使T、B淋巴细胞转化能力恢复或超过正常对照组水平,辐射照射后注射rhIL-18组的刺激指数达到了2.9〔刀豆蛋白A(ConA)组〕和6.1〔脂多糖(LPS)组〕;可促进辐照所致NK细胞活性抑制的恢复(P<0.05),使NK细胞对肿瘤细胞杀伤率达到21.8%～35.6%;上调CD4T细胞数量,达到50个/ml(P<0.05),提高辐照小鼠脾细胞分泌IFN-γ、GM-CSF和IL-2的能力(P<0.05),但对IL-4分泌能力和IgG产生能力没有调节作用。结论rhIL-18具有促进辐照小鼠免疫功能恢复的作用。

光敏生物素标记cDNA探针在肾综合征出血热实验诊断中的初步应用

本文用光敏生物素标记的R3 cDNA探针杂交检测了HFRS患者外周血淋巴细胞、血清和尿沉淀细胞中HFRS病毒核酸。结果42份淋巴细胞标本中30份为阳性,48份血清标本中有24份出现阳性杂交信号,81份尿沉淀细胞标本中53份为阳性,表明将此光敏生物素标记的cDNA探针用于HFRS实验诊断和致病机理的研究是可行的。

原位杂交方法在病毒性疾病中的应用

本文总结了近几年来原位杂交方法的进展情况,原位杂交方法在病毒性疾病诊断中的应用,及其在病毒致病机理研究中的作用,比较了原位杂交方法与其它方法的优缺点。