乳腺癌前病变组织原代成纤维细胞生物学特征初步研究

目的比较乳腺导管不典型增生成纤维细胞(atypical intraductal hyperplasia fibroblasts,AFs)与正常乳腺成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)、乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在生物学特征上的差异。方法采用Ⅰ型胶原酶法分离并培养AFs、NFs和CAFs,免疫细胞荧光化学检测其粘连蛋白(fibronectin,FN)表达以鉴定细胞纯度。比较3种细胞的细胞生长曲线、细胞周期和周期蛋白cyclin D1、p21waf1及p53的变化。结果获得并鉴定了NFs、AFs、CAFs;其生长速度依次增加(P<0.05),细胞周期S期百分比(8.24±2.47)、(16.94±4.77)、(33.31±7.90)依次增大(P<0.05);与NFs相比,AFs周期蛋白cyclin D1表达增加(P<0.05),p21waf1和p53蛋白表达降低(P<0.05);与CAFs相比,AFs的周期蛋白cyclin D1没有升高(P<0.05),p21waf1蛋白和p53蛋白表达更强(P<0.05)。结论 AFs相对于NFs和CAFs,细胞生长增殖具有特异性,这种变化提示乳腺肿瘤的癌前病变阶段AFs可能是NFs逐步向CAFs转变的过渡阶段。

人乳腺癌相关成纤维细胞对MDA-MB-231细胞的影响

目的探讨人乳腺癌相关成纤维(cancer associated fibroblasts,CAFs)细胞对MDA-MB-231细胞生长、增殖和侵袭的影响。方法实验分2组:MDA-MB-231细胞单独培养组(对照组)和MDA-MB-231与CAFs细胞共培养组(实验组)。以细胞计数法观察人乳腺癌CAFs细胞对MDA-MB-231细胞生长的影响;运用流式细胞术检测人乳腺癌CAFs细胞对MDA-MB-231细胞周期的影响;采用条件培养基,通过Transwell小室侵袭实验观察人乳腺癌CAFs细胞对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响。结果与对照组比较,实验组MDA-MB-231细胞的生长速度明显增强(P<0.05),细胞周期S期细胞百分比[(32.35±4.50)%]和细胞增殖指数PI[(42.91±2.44)%]明显增高(P<0.05);在CAFs细胞的条件培养基下,MDA-MB-231细胞的侵袭能力明显增强(P<0.01)。结论人乳腺癌CAFs细胞能够显著促进MDA-MB-231细胞的生长、增殖和侵袭。

人乳腺癌相关成纤维细胞的原代培养及其生物学特性

目的原代培养人乳腺癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast,CAF),并检测其生物学特性。方法采用胶原酶消化培养法对26份乳腺癌患者标本进行原代细胞分离培养,倒置显微镜下观察人乳腺癌CAF的形态学特性,免疫荧光染色法鉴定所分离培养的人乳腺癌CAF纤维连结蛋白(Fibronectin,FN)和成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activated protein,FAP)的表达,并通过MTT法和细胞计数法绘制细胞生长曲线。结果胶原酶消化法的最适酶浓度为0.12%,最适消化时间为10 h。原代培养23份成功,3份失败。培养成功的细胞贴壁生长,形态完整,生长状态良好,背景清晰,有明显的对数生长期,并可传代培养。培养的细胞FN和FAP表达阳性,表明原代培养的CAF为乳腺癌CAF。结论胶原酶消化培养法适合人乳腺癌CAF的原代培养,通过该方法可建立理想的人乳腺癌CAF体外实验模型。

人乳腺癌微环境中癌相关成纤维细胞的生物学特征

目的:研究人乳腺癌微环境中癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated ibroblasts,CAFs)的增殖、黏附、迁移、侵袭和凝胶收缩能力。方法:首先通过蛋白质印迹法检测细胞中纤黏蛋白(ibronectin,FN)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth-muscle actin,α-SMA)和成纤维细胞活化蛋白(ibroblast activation protein,FAP)的表达来鉴别验证原代分离培养的CAFs与正常成纤维细胞(normal ibroblasts,NFs)。然后采用罗氏xCellingence活细胞分析系统、细胞计数法和CCK-8(cell counting kit-8)法比较CAFs与NFs的增殖差异。再通过细胞黏附实验、罗氏xCellingence分析系统、Transwell小室侵袭实验和凝胶收缩实验分别比较CAFs与NFs细胞的黏附、迁移、侵袭和收缩的能力。结果:原代分离培养的人乳腺癌CAFs细胞和NFs细胞均生长状态良好,增殖活跃,生长曲线的线型及趋势均符合细胞生长特点,但CAFs细胞的增殖能力明显高于NFs细胞。与NFs细胞相比,CAFs细胞的黏附、迁移、侵袭和收缩能力均明显增强。结论:人乳腺癌微环境中的CAFs细胞与NFs细胞的增殖与迁移存在明显差异,与NFs细胞相比,CAFs细胞具有较强的增殖、黏附、迁移、侵袭和收缩能力。

癌相关成纤维细胞在肿瘤发生发展中的作用

肿瘤微环境在肿瘤发生、浸润、转移过程中扮演着十分重要的角色,癌相关的成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中最主要的基质细胞,在肿瘤的发生发展中有不可忽视的作用。CAFs对肿瘤的起始创造良好的"土壤",又分泌大量生长因子促进肿瘤的生长,分泌血管生成因子促进肿瘤血管的生成,并招募大量的炎症因子和分泌大量的可溶性产物到微环境中促进肿瘤细胞浸润和转移。因此,CAFs成为肿瘤靶向治疗的新目标,为临床肿瘤的综合治疗提供新的思路。

人端粒酶蛋白催化亚单位基因逆转录病毒真核表达质粒的构建及其对人乳腺癌相关成纤维细胞增殖的影响

目的构建人端粒酶蛋白催化亚单位(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)逆转录病毒真核表达质粒,并检测其在人乳腺癌相关的成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast,CAF)中的表达及其对CAF增殖的影响。方法扩增pIRES-EGFP-hTERT质粒,酶切回收hTERT片段,正向克隆至逆转录病毒载体pBABE-puro上,构建重组质粒pBABE-puro-hTERT,转染PT67细胞,进行逆转录病毒的包装。将PT67细胞上清感染原代培养的人乳腺癌CAF,荧光定量PCR和Westernblot分别检测hTERT基因在人乳腺癌CAF中的转录和表达,流式细胞术检测细胞的增殖情况。结果重组质粒pBABE-puro-hTERT经酶切和测序证实构建正确;与未处理的人乳腺癌CAF和感染pBABE-puro的细胞相比,感染重组质粒的人乳腺癌CAF中hTERT基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显增强,其增殖指数也明显增加(P<0.05)。结论成功构建了hTERT基因逆转录病毒真核表达质粒,其能增强人乳腺癌CAF的增殖能力,为乳腺癌微环境CAF的研究提供了良好的细胞模型。

医学检验专业本科生创新能力培养体系的构建与实践

为培养具有创新能力的复合型检验医学人才，构建了包含调整教学计划、改革教学方法、建立多元化实习基地、实施“雏鹰”计划和与国际接轨等内容的医学检验专业本科人才创新能力培养体系，经过实施，取得显著成效。

c-ski基因重组腺病毒质粒的构建及其对肿瘤相关成纤维细胞增殖的影响

目的构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响。方法以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-c-ski,经PmeⅠ线性化后,转化感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒,经PacⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒,经扩增及纯化后测定病毒滴度。将纯化的重组腺病毒感染乳腺癌CAFs,采用Western blot法检测感染细胞中c-Ski蛋白的表达水平;MTT法和细胞计数法检测重组腺病毒对CAFs细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;转染HEK-293细胞48 h后可见大量绿色荧光蛋白的表达,纯化的重组腺病毒的滴度为3.11×1010IFU/ml;感染重组腺病毒的乳腺癌CAFs中c-Ski蛋白的表达水平明显高于空病毒组和空白对照组(P<0.001),且增殖活力明显高于空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了表达c-ski基因的重组腺病毒质粒,其可明显促进CAFs的增殖,为进一步研究c-Ski对CAFs增殖分化等生物学功能的影响及作用机制提供了实验依据。

河南省玉米田根腐线虫三个病样品的病原种类鉴定

短体属线虫(Pratylenchus Flipjev,1936)又称根腐线虫,是一类重要的迁移性植物内寄生线虫,世界范围内分布广泛且危害性大,在我国多个省份皆有发生危害。本文采用改进的贝尔曼漏斗法从河南省商丘市、荥阳市和洛阳市的3个玉米土壤样品中分离出根腐线虫,利用光学显微镜进行形态学鉴定,基于rDNA的ITS和28S D2-D3区序列以及mtDNA-COI序列对供试根腐线虫进行了分子鉴定。形态学和分子生物学鉴定结果均表明来源于商丘样品的SY-1和SY-2种群分别为咖啡短体线虫(P.coffeae)和斯克里布纳短体线虫(P.scribneri);来源于荥阳样品的XY-1种群和洛阳样品的XC-250种群,均为斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)。基于rDNA-ITS、28S D2-D3区和mtDNA-COI序列构建的系统进化树结果与已知鉴定结果相一致,本研究鉴定的短体线虫种类,分别单独聚类在各自分支。本研究明确了河南省玉米田3个病样品的病原种类,发现采自商丘的病样品存在两种根腐线虫复合侵染的现象,且3个病样品均发现斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)的存在,研究结果为玉米根腐线虫病害的识别与防控提供了一定的科学依据。

扶贫脱贫,承上启下的“后勤官”

“咱们这片土地上盛产水果,为什么就不能脱贫致富呢?”前些年,这个疑问一直萦绕在太平乡各村村民的脑海里,也是村干部心里解不开的一个结。太平乡地处浙江省丽水市西北部,下辖19个行政村,人口2.3万,属于典型的农业乡镇。全乡以水果产业为主,水果种植面积达2.5万亩,蜜桔、白枇杷、无籽瓯柑、迎庆桃等知名果品享誉市内外。