大口黑鲈源维氏气单胞菌致病菌的分离鉴定及其毒力和耐药基因分析

【目的】分离大口黑鲈(Micropterus salmoides)患病组织中的致病菌,鉴定致病菌的生理特性,分析其毒力和耐药基因,以期指导临床科学用药。【方法】从广东湛江某养殖鱼厂的患病大口黑鲈病变组织中采集样本,采用稀释涂布法分离细菌,经16S rRNA基因序列比对和生化试验鉴定种属,并进行毒力基因、耐药基因和药敏特性等鉴定。【结果】分离出菌落形态呈圆形、表面光滑呈乳白色、不透明的细菌,编号为MSB-2。经革兰氏染色、生理生化反应等表型鉴定为革兰氏阴性菌中的气单胞菌属(Aeromonas)。通过扩增16S rRNA基因序列并构建系统发育树,进一步鉴定该菌为维氏气单胞菌(A.veronii)。该菌株具有act、aer、aexT等毒力相关基因及tetC、tetA、sull等耐药相关基因。药敏试验结果表明,该菌对羧苄西林、多西环素、头孢氨苄、新霉素、庆大霉素、头孢拉定、米诺环素、头孢唑林等药物敏感。对健康大口黑鲈进行人工回归感染病原菌后,出现与病鱼相似的临床症状,如腹鳍及胸鳍基部充血、肛门红肿、腹部明显膨大等,解剖发现腹腔有大量积液,与自然患病的症状相同。【结论】维氏气单胞菌是引起此次大口黑鲈疾病的致病菌,养殖过程中可选用新霉素、多西环素等批准渔用药物进行防治。

大口黑鲈肠道益生菌的分离与鉴定

【目的】分离鉴定大口黑鲈(Micropterus salmoides)肠道益生菌,评估分离菌用作饲料添加剂的益生潜力。【方法】采集大口黑鲈肠道样本,采用稀释涂布法分离细菌,经16S rRNA序列比对和生化试验鉴定种属,并进行抗逆性能、黏附能力、溶血活性和药敏特性等鉴定。【结果】从大口黑鲈肠道分离菌株84株,经测序、blast比对,筛选出3株同源性最高的菌株MS-1、MS-2、MS-3,分别鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。3株分离菌均为γ-溶血,不具有生物膜,疏水性50%~93.3%,自凝集性43.6%~69.2%;可在pH 2.0~12.0环境和5.0 g/L胆盐中存活;经高温处理后仍可生长;3株菌对大多数抗生素敏感。【结论】芽孢杆菌MS-1、MS-2和MS-3抗逆性高,黏附性能及饲料学安全性高,可作为大口黑鲈养殖中潜在益生菌。

乌鳢半胱氨酸蛋白酶3基因克隆及表达分析

【目的】克隆和表达分析乌鳢(Channa argus)的半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase)3基因(caspase-3),为探究该基因在乌鳢机体中的免疫应答作用及在其他鱼类免疫上的作用提供理论依据。【方法】根据NCBI公布的乌鳢基因组信息,对乌鳢的caspase-3基因序列进行克隆,对推导的caspase-3氨基酸序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测caspase-3基因在健康乌鳢各组织中的表达分布及在不同刺激物[鰤鱼(Seriola quinqueradiata)诺卡氏菌(Nocardia seriolae)、脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(PolyI:C)]刺激下的时序表达情况。【结果】caspase-3基因序列全长855 bp,编码284个氨基酸残基,蛋白分子量为31.069 kD,理论等电点(p I)为6.17。caspase-3蛋白含有1个CASc结构域。多序列比对结果显示,乌鳢的caspase-3氨基酸序列与秘鲁笛鲷(Lutjanus peru)的caspase-3氨基酸序列相似度最高,达81.7%;系统发育进化树分析结果表明,乌鳢的caspase-3氨基酸序列与秘鲁笛鲷的caspase-3氨基酸序列聚为一支。实时荧光定量PCR检测结果表明,乌鳢caspase-3基因在肌肉、皮肤、鳃、心脏、胸腺、脑、头肾、脾脏、肝脏和血液等组织中均有表达,其中在脾脏和头肾的表达量最高;在不同刺激物刺激下,caspase-3基因在乌鳢脾脏、肾脏、血液和肝脏组织中的表达量均发生显著变化(P<0.05);用灭活鰤鱼诺卡氏菌、LPS和PolyI:C孵育乌鳢头肾白细胞后,caspase-3基因表达量均显著升高,且具有明显的时间依赖性。【结论】乌鳢caspase-3基因可能在乌鳢抵御细菌和病毒入侵的免疫反应中发挥着重要作用。