多囊蛋白1表达载体的构建及表达

目的 :体外表达并纯化多囊蛋白 1胞外区片段。方法 :提取健康人肾组织总 RNA,用一步法 RT- PCR选择扩增编码多囊蛋白 1胞外多拷贝区的 2个 c DNA片段 ,并将之克隆到融合蛋白表达载体 p QE30中 ,转染含有阻遏质粒 p REP4的大肠杆菌 M15。异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达融合蛋白 ,用亲和层析法纯化。纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定。 结果 :克隆到 2个编码多囊蛋白 1胞外区的 c DNA片段 ,其大小分别为 5 0 2 bp和 4 71bp。构建的表达质粒p QE30 - PK D1e1和 p QE30 - PK D1e2经限制性内切酶酶切和 DNA测序证实为所需要的质粒。表达出相对分子质量分别为19 80 0、1890 0的融合蛋白 ,经蛋白质印迹分析鉴定为多囊蛋白 1的融合蛋白。结论 :本实验克服了 PK D1基因在体内多个同源序列的干扰 ,克隆了编码多囊蛋白 1胞外多拷贝区的 c DNA序列 ,并成功地获得了融合表达的目的蛋白 ,为进一步制备抗多囊蛋白

抗多囊蛋白1氨基端单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :用杂交瘤技术制备抗多囊蛋白 1胞外区氨基端的单克隆抗体 (mAb) ,并对其特异性进行鉴定。方法 :以肾组织总RNA为模板 ,用RT PCR扩增多囊蛋白 1胞外区氨基端的编码基因PKD1cDNA。将该基因克隆到融合蛋白表达载体pQE3 0中 ,转染大肠杆菌M15。以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达多囊蛋白 1胞外区氨基端的组氨酸融合蛋白 (PC1 e2 ) ,用亲和层析法纯化。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠 ,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2 / 0进行细胞融合 ,间接ELISA筛选阳性克隆 ,有限稀释法进行单克隆化。mAb的特异性用间接ELISA和Westernblot鉴定。结果 :克隆到两个编码多囊蛋白 1氨基端的cDNA片段 (50 2bp和 471bp)。构建的表达质粒经酶切和DNA测序证实 ,为所需要的质粒。表达出相对分子质量 (Mr)分别为 1980 0和 1890 0的融合蛋白 ,经Westernblot鉴定 ,均为多囊蛋白 1的融合蛋白。用Mr 为 1890 0的融合蛋白免疫小鼠 ,得到杂交瘤细胞株 7B1。Westernblot分析表明 ,该细胞株分泌的mAb能特异地与多囊蛋白 1氨基端结合。结论 :本实验表达了PKD1多拷贝区所编码的PC1 e2 ,成功地制备了抗多囊蛋白 1胞外区N端的mAb。

中年原发性高血压患者血压变异性与高血压早期肾损伤的关系

目的探讨中年原发性高血压患者随诊期间血压变异性与早期肾损伤的关系。方法通过检测59例中年I-Ⅱ级的原发性高血压患者的尿微量白蛋白（mAlb）和尿N-乙酰-p—D氨基葡萄糖苷酶（NAG），将其分为早期肾损伤组（尿mAlb和／或尿NAG阳性，19例）和无肾损伤组（尿mAlb和尿NAG阴性，40例）。回顾性分析其过去24个月间8次随诊时血压值，用随诊期间血压变异标准差（SD）和血压变异系数（CV）评价2组患者随诊期间血压变异性的差异。结果早期肾损伤组和无肾损伤组患者尿mAlb分别为（34±14）、（14±3）mg／24h，尿NAG分别为（29±15）、（10±4）U／L，组间比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）。早期肾损伤组随诊期间SBP。SD、SBP—CV明显高于无肾损伤组[SBP—SD：（10．1±2．2）mm Hg（1mm Hg=0．133kPa）比（5．4±1．9）mmHg；SBP—CV：（7．1±1．8）mmHg比（3．8±1．4）／mm Hg，均P〈0．01]。结论中年原发性高血压患者随诊期间SBP—BPV与其早期肾损伤密切相关，可能预测早期高血压肾病的发生。

我国2006年野鸟H5N1 HPAIV表面基因进化特征

国家禽流感参考实验室在2006年,从来自青、藏两省(区)3种野鸟及辽宁省的2种死亡的野鸟体内共分离到14株H5N1亚型高致病力禽流感病毒(High pathogenic avian influenza virus,HPAIV),比较发现其HA、NA基因核苷酸的同源率在97.9%～99.9%之间。所有病毒的HA基因的裂解位点均具有HPAIV特有的连续碱性氨基酸-RRRKKR-,并具有近年来H5N1亚型流行株所特有的NA基因颈部49～68位20个氨基酸缺失及NS基因80～84位5个氨基酸的缺失;遗传进化分析表明2006年野鸟病毒由2005年野鸟病毒进化而来,并形成独立的进化分支;辽宁省近2年的4株野鸟病毒亲缘关系较近,说明引起2005年该省锦州地区H5N1 HPAI疫情的病毒在该地区的野鸟体内继续存在。

影响临床期2型糖尿病肾病病情转归的危险因素探讨

目的探讨影响临床期2型糖尿病肾病(DN)并高血压患者病情转归的危险因素。方法跟踪随访50例临床期2型DN合并高血压患者,所有患者均经积极降压、降糖、降脂等对症治疗,3年后将肾功能显著恶化[肾小球滤过率估算值(eGFR)较基线值下降30%]或发生心脑血管并发症列为观察终点事件并定义为预后不良。按有无终点事件(包括复合终点事件)分为两组,分析其体质量指数、糖化血红蛋白、血脂、尿蛋白排泄率、血压及血压变异性(BPV)等临床资料。结果单因素分析表明,两组患者3年前的年龄、性别、血压、尿蛋白排泄率、糖化血红蛋白、血脂、eGFR等基线资料无统计学差异(P>0.05)。但3年后,其体质量指数、收缩压变异系数(SBP-BPV)、尿蛋白排泄率、血胆固醇、血尿酸的检测指标比较均有统计学差异(P<0.05),且可能为影响预后的因素,经多因素logistic回归分析,SBP-BPV为本组病人预后不良的主要危险因素(B=0.969,OR=2.637,P=0.001)。结论临床期DN的预后同多种因素有关,其中SBP-BPV为预后不良的主要危险因素,应引起重视并进行积极干预。

牙科氧化锆陶瓷材料循环疲劳性能的实验研究

目的:观察循环加载对Wieland及Aidite两种牙科氧化锆陶瓷强度的影响。方法:选取相同规格的Wieland及Aidite两种品牌的牙科氧化锆陶瓷瓷盘,制作20 mm×4 mm×2 mm试件,每种陶瓷20个试件,各随机分为4组(n=5)分别进行0、103、104、105次循环加载,加载后测试试件弯曲强度的变化;利用CurveExpert软件拟合曲线,得出弯曲强度变化规律,并对数据进行Weibull分析。结果:循环后两种陶瓷材料的三点弯曲强度均呈下降趋势;其中Wieland陶瓷三点弯曲强度组间无显著差异(P>0.05),Adite陶瓷三点弯曲强度105组与未加载组及103加载组比较强度下降明显(P<0.05)。Curve Expert曲线拟合结果可见材料初始受载荷影响较小,一定循环次数加载后,强度会迅速下降,直至失效。Weibull分析结果表明经过循环后两种陶瓷Weibull模数呈先上升后下降趋势,特征强度呈下降趋势。结论:循环疲劳会降低氧化锆陶瓷材料的强度,随循环次数的增加,强度逐渐下降,至一定循环次数后,强度迅速下降,导致失效。

土鳖虫水煎剂对人多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖的影响

目的 :观察中药土鳖虫对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖的影响。方法 :以灌服中药土鳖虫水煎液的 SD大鼠血清为含药血清 ,灌服等量生理盐水的 SD大鼠血清为对照血清。将囊肿衬里上皮细胞培养于含有下述物质的 RPMI 16 4 0液中 :(1)上皮生长因子 (EGF) 0、2 .5、5、10、2 0 ng/m l;(2 )含药血清 1%、2 .5 %、5 % ,以等量对照血清为对照 ;(3) EGF 10 ng/ml分别加含药血清 1%、2 .5 %、5 % ,并以等量 EGF加对照血清作为对照。培养 4 8h后 ,以 5 -溴 - 2 -脱氧尿核苷嘧啶 (Brdu)掺入法检测细胞增殖。结果 :EGF能显著地刺激囊肿衬里上皮细胞增殖 ,一定范围内呈剂量依赖性 ;与对照血清比较 ,土鳖虫含药血清能明显抑制经或未经 EGF刺激的囊肿衬里上皮细胞增殖 ,并呈剂量依赖性。结论

工程项目管理探讨

随着中国的进一步改革开放,工程项目管理像在发达国家那样越来越受到企业界、管理界的青睐,是一个必然的趋势。本文从工程项目管理的特点、重点内容及支持体系三个方面对其进行探讨,希望能给国内企业提供借鉴和帮助。

中国H5N1亚型高致病性禽流感病毒抗原变异株的鉴定分析

对引起中国2006年山西、宁夏2省(区)H5N1亚型禽流感疫情的代表毒株——A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)(CK/SX/06)进行了全面研究。结果表明该病毒具有高致病性禽流感病毒(HPAIV)特征,基因组序列分析发现其8个基因片段与中国传统H5N1亚型禽流感病毒GS/GD/1/96(H5N1)存在较大差异,属于新的基因型——山西鸡型;抗原性分析结果表明其在抗原性方面与GS/GD/1/96同样存在较大变异,将其命名为"山西鸡型"抗原变异株;以106EID50.0.1 mL-1剂量将该病毒经鼻腔接种4周龄SPF鸭以评价其对水禽的感染能力,结果表明其不感染鸭;常规方法接种BALB/c小鼠以评价其对哺乳动物的感染和致病能力,结果表明其能感染小鼠,但不引起死亡,呈低致病力。说明该类型高致病性H5N1 HPAIV目前仅危害鸡,不具备感染水禽的能力,感染哺乳动物但不致死。该类型病毒的出现与流行为中国禽流感的免疫与防制提出新的课题。

知识型员工工作态度与工作绩效关系的实证研究

依据相关文献与研究假设,构建了知识型员工的工作态度与工作绩效关系模型。通过实证研究得出知识型员工的工作态度与其工作绩效之间存在着显著正相关的结论,同时发现知识型员工的个体差异,如性别、年龄、学历、工作年限和工作性质等对工作态度、工作绩效均有显著性影响。

自主神经功能紊乱中医辨证分型

自主神经功能紊乱既可以独立为一种疾病,又可以各种散见的症状伴随于其他各系统的疾病之中。当自主神经功能紊乱时可以出现全身各系统的症状,这些复杂多变的临床症状给治疗带来很大困难,我们不能通过一种西药改善自主神经功能紊乱带来的诸多症状,但我们可以应用中医辨证理论把出现于同一患者身上的许多症状归结为一种中医证型,辨证论治,随证加减。

Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞凋亡的影响

摘 要 目的:观察Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞 (HKC)凋亡的影响,探讨Cyr61在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)发病中的作用及机制。 方法:RT PCR扩增Cyr61基因全长,构建pcDNA3. 1 +Cyr61重组质粒,转染并筛选获得稳定转染pcDNA3. 1+Cyr61的HKC细胞。经RT PCR、Northern、Westernblot鉴定转染细胞系基因的整合及表达。对空白HKC、空质粒pcDNA3. 1转染的HKC、Cyr61转染的HKC和囊肿衬里上皮细胞去血清培养 72h后,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Westernblot检测磷酸化Akt和Bad含量。 结果:构建了pcDNA3. 1+Cyr61重组质粒并获得稳定转染该质粒的HKC细胞。空白HKC与质粒pcDNA3. 1转染组之间上述指标无显著差异(P>0 05),Cyr61基因转染组与空白组、pcDNA3. 1转染组相比,凋亡指数显著降低 (P<0. 01),磷酸化Akt和磷酸化Bad含量显著增高 (P<0 .01 ),Cyr61基因转染组与囊肿衬里上皮细胞之间上述指标无显著差异 (P>0. 05);在Cyr61抗体存在下,Cyr61基因转染组的上述指标与空白组无显著差异 (P>0 .05 )。 结论:过表达Cyr61的HKC对去血清诱导的凋亡特性与囊肿衬里上皮细胞相似,过表达的Cyr61可能通过自分泌途径,促进Akt和Bad磷酸化,抑制细胞凋亡,参与ADPKD囊肿形成和发展。

牛磺酸抑制血小板衍生生长因子诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌

目的 :观察牛磺酸对血小板衍生生长因子 (PDGF)诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响 ,并探讨其作用的可能机制。 方法 :体外传代培养的大鼠系膜细胞 ,经一定量的牛磺酸和 (或 ) PDGF作用 4 8h后 ,用噻唑蓝 (MTT)法检测细胞增殖 ,流式细胞术检测细胞周期 ,EL ISA方法检测细胞外基质 ( 型胶原及层粘连蛋白 )含量 ,免疫细胞化学方法检测 C- jun、C- fos的表达。 结果 :与对照组比较 ,10、2 0 ng/ ml PDGF可明显促进系膜细胞增殖 ,影响细胞周期 ,使 G0 ～ G1 期细胞减少 ,S期细胞增加 ,并能明显促进细胞外基质的分泌及 C- jun、C- fos的表达 (P<0 .0 1) ,而 2 0或 4 0 mm ol/ L 牛磺酸作用于系膜细胞后 ,可明显抑制 PDGF(2 0 ng/ ml)诱导的细胞增殖、细胞外基质分泌及 C- jun、C- fos的表达。 结论 :牛磺酸对 PDGF诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌有显著抑制作用 ,其机制可能与牛磺酸抑制 C- jun、C-

慢性肾脏疾病1～3期合并高血压与原发性高血压患者的动态血压对比研究

目的 24 h动态分析慢性肾脏疾病（1~3期）合并高血压（HCKD）患者的血压变化,并与原发性高血压（PH）患者的血压进行比较。方法选择2013年1月至2014年1月海军总医院肾内科收治的HCKD患者52例作为HCKD组,另外选取47例PH患者作为PH组,对两组患者行24 h动态血压以及血压变异性检测,对两组患者的24 h舒张压（24 h-SBP）、24 h收缩压（24 h-DBP）、日间和夜间血压平均值以及收缩压和舒张压变异性进行统计分析。结果 1血压比较：HCKD组24-DBP、夜间收缩压、夜间舒张压分别为（81.5±13.2）mm Hg、（162.0±17.2）mm Hg、（82.4±16.5）mm Hg,均高于PH组（71.8±12.0）mm Hg、（140.3±25.6）mmHg、（66.8±20.1）mm Hg,差异均有统计学意义（P〈0.01）。2血压变异性比较：HCKD组24 h收缩压变异性和舒张压变异性分别为（14.4±3.5）mm Hg、（9.5±1.2）mm Hg,均高于PH组（11.3±2.6）mm Hg、（7.8±1.3）mm Hg（P〈0.05）;HCKD组夜间收缩压变异性和夜间舒张压变异性分别为（9.4±2.5）mm Hg、（9.4±2.5）mm Hg,均高于PH组（7.7±2.2）mm Hg、（9.1±2.4）mm Hg,差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论肾性因素参与的高血压患者血压趋势紊乱,夜间血压及变异性明显增加,是肾功能继续恶化的重要因素。

长链 PCR在中国汉族人多囊肾病 1型致病基因突变检测中的应用(英文)

目的 :研究特异性分离中国汉族人多囊肾病 1型致病基因 (polycystic kidney disease gene 1,PKD1)多拷贝区的方法 ,以排除同源序列对该基因突变检测的干扰。 方法 :利用与同源序列间的个别碱基差异设计 8对能涵盖 PKD1多拷贝区的长链 PCR引物 ,分别对两例健康汉族人基因组 DNA进行 PCR,其扩增产物通过巢式 PCR进行序列测定。 结果 :通过优化PCR体系 ,尤其是以高质量基因组 DNA为模板 ,适当提高退火温度 ,经巢式 PCR测序证实扩增产物序列与 PKD1多拷贝区一致。 结论 :该研究采用的长链 PCR体系可克服同源序列的影响 ,适用于中国汉族人 PKD1多拷贝区的特异性扩增 ,为进一步通过单链构象多态性分析检测汉族人 PKD1突变位点奠定基础。

角质细胞生长因子对囊肿衬里上皮细胞细胞周期及其调控蛋白表达的影响

目的:研究角质细胞生长因子(KGF)对常染色体显性多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞细胞周期及其调控蛋白的影响,以初步探讨ADPKD囊肿发生、发展的细胞学机制.方法:应用MTT法检测KGF对ADPKD囊肿衬里上皮细胞的促增殖作用;应用流式细胞仪观察KGF对ADPKD囊肿衬里上皮细胞细胞周期的影响;应用免疫组化结合病理图文检测KGF对囊肿衬里上皮细胞细胞周期调控蛋白Cyclin D1、P21wafl表达影响.结果:①KGF能明显促进ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖,影响细胞周期,使G0～G1期细胞减少,S期细胞增多;②体外培养的ADPKD囊肿衬里上皮细胞存在CyclinD1和P21wafl蛋白,经图文分析,50 ng/mlKGF刺激后,Cyclin D1蛋白表达(0.41±0.04)较对照组(0.30±0.01)明显增强,P21wafl的表达(0.32±0.02)较对照组(0.37±0.03)明显减弱(P＜.01).结论:CyclinD1和P21wafl是ADPKD囊肿衬里上皮细胞细胞周期G1期进展的调控蛋白;KGF可能通过刺激Cyclin D1蛋白的表达,抑制P21wafl蛋白的产生,从而进一步促进细胞通过G1～S调控点,致使ADPKD囊肿衬里上皮细胞明显增殖.

人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA及表达载体的构建

目的针对I型胶原α1(I)链设计、构建人鼠同源的Ⅰ型胶原siRNA(COL1A1-siRNA)及其表达载体,并证实其有效性。方法利用软件设计人鼠完全同源的一对Ⅰ型胶原siRNA序列,并构建其表达载体。直接将I型胶原siRNA和构建的质粒转染至大鼠系膜细胞,利用RT-PCR方法观察对系膜细胞I型胶原蛋白表达的抑制作用。结果Ⅰ型胶原siRNA转染至大鼠系膜细胞后,与空白对照组及MOCK组比较,能够抑制Ⅰ型胶原的表达。其质粒对Ⅰ型胶原表达的抑制作用更加显著,呈剂量依赖性。结论所设计的Ⅰ型胶原siRNA为人与大鼠完全同源的siRNA序列,所有碱基完全匹配。可以成功转染到大鼠系膜细胞,并有效抑制I型胶原在细胞内的表达。质粒载体的方法同样能够抑制Ⅰ型胶原的形成,而且表达更稳定,作用更显著。

表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的表达、纯化及活性测定

目的:采用原核表达体系对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)受体型酪氨酸激酶(recep-tor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达、纯化及活性鉴定。方法:以包含EGFR cDNA的pRK5质粒为模板,PCR选择扩增编码EGFR-RTK的cDNA片段,插入pQE30质粒后转染大肠杆菌M15。IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体蛋白经复性后亲和层析法纯化,ELISA方法测定蛋白活性。结果:成功地将933 bp的EGFR-RTK cDNA片段插入载体pQE30中,构建了表达载体pQE30-RTK。经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为37 000的EGFR-RTK融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的65.2％。复性、纯化后的EGFR-RTK蛋白经ELISA检测,结果发现随着加入蛋白量的增加,酶促反应产物磷酸化酪氨酸的量也逐渐增加,两者具有线性关系。结论:本实验成功地利用原核表达系统表达了具有生物学活性的EGFR-RTK,较传统的昆虫细胞表达系统更为简便、经济。

基于自适应灰色面板聚类的城市公共安全风险测度

为科学评估城市公共安全风险,基于“脆弱性—能力”综合评估框架从公共安全风险事件维度入手,构建城市公共安全风险评估指标体系;选取2015—2019年与脆弱性和风险承载能力相关的22个指标,采用改进后的自适应灰色面板聚类从绝对量、增量和波动量3方面进行测度。聚类结果将全国城市的公共安全风险水平分为6个类型;基于研究结果进一步分析造成不同类型特征的原因,明确各城市公共安全管理存在的薄弱点,提出相关改进建议。研究结果表明:北京和上海在3个层面上均有较好表现,属于低风险城市;全国大部分地区呈现出绝对量水平中等或较差,增量和波动量水平较好的特征。