连翘酯苷脂质体在雏鸡体内的药动学研究

试验旨在考察连翘酯苷脂质体静脉给药后在雏鸡体内的药物动力学和组织分布。将连翘酯苷脂质体与连翘酯苷水溶液分别以20mg/kg体重剂量给雏鸡静脉注射,于不同时间点取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织和血液。HPLC法测定各时间点血液及各组织中连翘酯苷浓度。连翘酯苷脂质体和连翘酯苷溶液的血药浓度—时间曲线均符合二室开放模型,药动学参数消除半衰期(t1/2β)分别为(1.79±0.050)和(0.11±0.006)h,药时曲线下面积(AUC)分别为(39.95±2.32)和(4.26±0.39)(μg·h)/mL,体清除率(CLs)分别为(0.56±0.04)和(4.73±0.41)mg/(h·kg),连翘酯苷脂质体给药后在肝脏、脾脏、肺脏中的分布较连翘酯苷水溶液有明显提高。连翘酯苷脂质体明显改变了连翘酯苷的药动学行为,与游离药物相比,其有效延长了药物作用时间,在网状内皮系统丰富的组织有靶向性聚集作用。

Smad泛素化调节因子2siRNA的筛选及转染原代肾小管上皮细胞条件的优化

试验旨在优化Smad泛素化调节因子2（Smurf2） siRNA最佳转染条件，筛选最佳siRNA干扰片段，进而实现对Smurf2基因的瞬时沉默，为研究Smurf2基因在马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephrohathy，AAN）中的作用奠定基础。本研究通过培养小鼠原代肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells，RTECs），并以脂质体LipofectamineTM 2000为转染介质，将Smurf2 siRNA转染入RTECs；通过观察绿色荧光的表达量及Real-time PCR反应优化转染条件，转染后Real-time PCR检测mRNA表达抑制率。CCK-8法检测Smurf2 siRNA复合物对RTECs活性的影响；同时，用Real-time PCR和Western blotting检测不同位点Smurf2 siRNA对Smurf2 表达的影响。结果显示,当Lipofectamine TM 2000与siRNA比例为1.5 μL∶30 pmol时，转染效率最高，为70%～80%；Smurf2-619 siRNA干扰效果最明显；与正常组相比，转染siRNA组的Smurf2蛋白表达水平显著下降（P〈0.05）。最终确定了Smurf2 siRNA最佳转染条件，其中Smurf2-619 siRNA对Smurf2 表达的抑制率最高。

4种方法建立大鼠糖性白内障模型的比较研究

试验旨在研究D-半乳糖饲喂及D-半乳糖、葡萄糖和链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射4种方法能否成功建立大鼠糖性白内障模型,并在此基础上探讨各种方法的优缺点,以期找出一种快速、有效、安全性高、实用性及可重复性强的大鼠糖性白内障模型建立方法,并为犬糖性白内障模型建立提供理论依据。本试验采用D-半乳糖饲喂(日粮30%)及50%D-半乳糖(15g/kg)、50%葡萄糖(15g/kg)和STZ(70mg/kg)腹腔注射4种方法对同日龄大鼠进行模型建立,试验周期为30d,给药48h后尾静脉穿刺测定血糖,72h后用裂隙灯检查晶状体变化情况,每隔3d测定体重变化,同时每天测定饮水量及摄食量。试验结果显示,D-半乳糖饲喂组晶状体无异常变化;D-半乳糖腹腔注射组和葡萄糖腹腔注射组血糖始终未达到糖尿病血糖标准,但均在第3天可见白内障发生;STZ腹腔注射组在72h动物出现糖尿病症状,4～5周诱发白内障。结果表明,D-半乳糖饲喂不能使大鼠产生白内障;D-半乳糖腹腔注射及葡萄糖腹腔注射仅需3d即可诱发白内障,快速且成模率高,适合进行白内障药物延缓效应的研究;STZ腹腔注射需4～5周建立糖性白内障模型,因而更适用于研究糖性白内障的发病机制。

马兜铃酸肾病中相关因子的表达变化

本研究旨在探讨马兜铃酸肾病(AAN)中标志性因子的表达变化。30只小鼠灌胃8mg/(kg·d)马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ),于不同时间处死,用常规病理切片染色法观察肾脏不同时间段的病理变化程度,以实时荧光定量PCR和Western blotting检查各组小鼠肾组织细胞标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、角蛋白18(CK-18)、波形蛋白(vimentin)的表达变化。结果显示随着AAⅠ用药时间的延长,肾脏损伤逐渐加重,并证实AAⅠ可诱导小鼠肾脏发生上皮—间质转分化(EMT),促进α-SMA、vimentin的mRNA及蛋白表达增加,抑制CK-18的表达,为AAN更深一步的机制研究提供有力的理论基础。

泛素化调节因子2真核表达质粒的构建及其在原代肾小管上皮细胞的表达

本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mR-NA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。

不同剂量链脲佐菌素及不同性别大鼠糖性白内障模型的比较研究

本试验旨在研究不同剂量链脲佐菌素(streptozocin,STZ)及不同性别在建立大鼠糖性白内障模型方面的差异。将65、70和75mg/kg 3个浓度STZ通过一次性腹腔注射建立雌、雄性大鼠糖性白内障模型,36h后尾静脉采血测血糖,3周后进行裂隙灯检查,每天测量动物饮食量及排粪尿量变化,每周测定体重。试验结果显示,70mg/kg STZ比65mg/kg STZ糖性白内障发生时间缩短约1周,且比75mg/kg STZ死亡率低。同浓度STZ腹腔注射后雌性大鼠糖尿病发生时间为72h,雄性大鼠为36h,白内障发生时间雌性比雄性大鼠慢约1周。试验结果表明,腹腔注射70mg/kg STZ在糖性白内障模型建立所需时间及模型稳定性等方面具有优势,雄性大鼠较雌性更易于建立糖性白内障模型。

犬氧化损伤诱发白内障模型及其评价标准的研究

犬白内障是常见的眼科疾病,发病率高,严重影响犬的视力。有研究表明氧化损伤是重要的发病机制之一,目前对其疾病模型与发病机理研究较少。本研究旨在建立犬老年性白内障动物模型,为其后续机理研究奠定基础。本试验选取健康成年犬10只,随机选取6只为模型组,4只为对照组,用Fenton液造模。裂隙灯观察晶状体的混浊情况,光镜和透射电镜观察形态结构的变化,测定晶状体生化指标的改变,判定造模结果。与对照组相比,模型组晶状体混浊度变化明显,光镜和电镜下能观察到凋亡现象,T-SOD、GSH-Px和MDA值差异显著(P<0.05)。本试验证明用Fenton液囊袋内注射即可成功建立犬老年性白内障疾病模型。

Dab2在马兜铃酸肾病小鼠肾脏中的表达变化

本试验旨在研究Dab2蛋白在马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy,AAN)小鼠模型中的表达变化。在AAN小鼠模型的基础上,利用免疫组化、荧光定量PCR和Western blotting技术对肾脏中Dab2基因转录水平和蛋白表达水平进行检测。结果显示,随着用药时间的延长,肾脏组织损伤程度加重;Dab2蛋白表达量在第6天先降低(P>0.05),在第12天突然升高随后又极显著降低(P<0.01),Dab2蛋白表达总体呈上升趋势,Dab2基因转录水平变化趋势与此一致;同时Dab2蛋白的定位也发生了变化,完成了从刷状缘到细胞质,再到细胞核的转移。结果表明Dab2蛋白参与AAN小鼠的发病过程,为进一步研究Dab2蛋白在AAN中的作用奠定理论基础。

表没食子儿茶素没食子酸酯和牛磺酸联用对犬白内障模型晶状体上皮细胞凋亡的影响

为提供兽医临床用药治疗白内障的理论依据,选取健康成年犬15只(30眼),随机分为模型组、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)组、牛磺酸、EGCG联合牛磺酸组和对照组,每组6个重复。除对照组外其他组用fenton液造模。裂隙灯观察晶状体的混浊情况,并根据国际通用的晶状体混浊分类体系Ⅲ(LOCSⅢ)分类,当混浊达到II期时用药治疗。临床用药40d后,取出晶状体透射电镜观察形态结构的变化;免疫组织化学法测定晶状体上皮细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达水平;qRT-PCR测定其mRNA的表达水平。结果表明,与模型组相比联合组中Bax/Bcl-2的比值和Caspase-3的表达较模型组显著降低(P<0.05),证明联合用药可以通过上调凋亡基因Bcl-2的表达抑制细胞凋亡。

连翘酯苷诱生干扰素-γ对AAⅠ诱导的RTECs转分化的影响

体外培养小鼠RTECs,将其随机分为6组,CCK-8法测连翘脂苷对RTECs的增殖率及存活率的影响,ELISA检测转化生长因子β1(TGF-β1)和干扰素-γ的含量,RT-PCR和Western blot检测CK18和Smad7等相关因子的表达变化。结果显示连翘酯苷质量浓度为160mg/L以下对RTECs无毒性,且诱生干扰素2.392μg/L;用药E组与模型B组比较TGF-β1表达显著下降(P<0.01);用药组与模型组相比Smad7mRNA极显著高表达(P<0.01)、CK18mRNA显著高表达(P<0.05),而vimentin、α-SMA mRNA抑制表达(P<0.01);Western blot结果表明上调了Smad7的表达量。试验表明连翘脂苷可以提高Smad7的表达量,阻止Smad2/Smad3磷酸化,抑制TGF-β1/Smads信号通路,有效改善AAI诱导的肾小管上皮细胞转分化。