弓形虫ROP5基因真核表达载体的构建及其免疫保护性的研究

目的构建弓形虫pcDNA-ROP5真核表达载体,观察弓形虫ROP5基因在小鼠体内诱导的免疫反应。方法克隆弓形虫ROP5基因,将其插入真核表达载体pcDNA-3.1中构建重组质粒pcDNA-ROP5,脂质体法转染Hela细胞体外表达蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定。将45只小鼠随机均分为3组,分别为PBS组、空质粒组、pcDNA3.1-ROP5组,每2w肌注免疫(100μg/只)1次,共3次,于免疫前及每次免疫前1d和末次免疫后2w收集小鼠血清,用间接ELISA法检测血清抗弓形虫的IgG。各组小鼠腹腔注射RH株弓形虫速殖子1 000个/每鼠,观察小鼠受攻击感染后的存活时间。结果真核表达载体构建成功,Western blotting分析结果显示,重组质粒pcDNA3.1-ROP5能在Hela细胞表达,蛋白相对分子质量为61kDa。pcDNA3.1-ROP5末次免疫后血清中IgG水平显著高于其他组,pcDNA-ROP5免疫的小鼠与对照组相比,实验组小鼠产生了明显的体液免疫应答。攻击感染试验中,实验组的小鼠比对照组的存活时间有明显延长。结论构建的真核表达重组质粒pcDNA-ROP5对抗击弓形虫攻击感染能够激发一定的免疫保护性。

弓形虫复合基因疫苗pcSAG1-ROP5诱导小鼠免疫应答的研究

目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5，分别通过PCR、酶切和测序鉴定后，转染人宫颈癌细胞（HeLa细胞），蛋白印迹（Westernblotting）分析重组蛋白的体外表达情况。70只昆明小鼠随机均分为5组（每组14只），分别为pc-SAGl组、pcROP5组、pcSAGl-ROP5组、空质粒组和空白对照组。重组质粒组每次每只肌注100μg重组质粒，每2周免疫1次，共3次。空质粒组和空白对照组分别注射等量的空质粒和PBS。于每次免疫前和末次免疫后2周眼眶采血。制备血清。采用ELISA法检测pcSAGl-ROP5组小鼠末次免疫后2周的血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价，以及5组小鼠的各次血清中抗弓形虫抗体IgG水平。末次免疫后3周，每组小鼠取10只腹腔接种10s弓形虫速殖子，观察生存时间。末次免疫后4周，采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中r干扰素（IFN-r）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果重组真核表达质粒构建成功。Westernblotting分析结果显示，重组质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5均能在HeLa细胞中表达，重组蛋白的相对分子质量（尬）分别为31000、57000和88000。pcSAGl-ROP5组小鼠血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价分别为1：320、1：160和1：2560。3个重组质粒组小鼠血清抗弓形虫IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间的延长逐渐升高，末次免疫后2周，pcSAGl-ROP5组小鼠血清IgG抗体水平（0．612±0．031）显著高于其他各组（P〈0．05）。攻击感染后，pcSAGl-ROP5组小鼠的平均存活时间为（288±7）h，较pc—SAGl组和pcROP5组分别延长了48h和96h（P〈0．05）。末次免疫后4周，pcSAGl-ROP5组小鼠脾细胞培养上清中IFN-1水平[（908．52±6．31）pg／m1]显著高于其他各组（P〈0．05），各组的IL-4水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论与弓形虫单基因疫苗pcSAGl和pcROP5相比，复合基因疫苗pcSAGl-ROP5所诱导的抗弓形虫IgG抗体和IFN-1水平较高，攻击感染后存活时间延长。

弓形虫ROP5基因与基因佐剂IL-12对小鼠免疫保护性

目的观察弓形虫ROP5基因疫苗和基因免疫佐剂IL-12共免疫对昆明小鼠所诱导的免疫保护性。方法大量制备重组质粒pcROP5和pcmIL-12,以100μg的剂量同时免疫昆明小鼠,PBS组和pcDNA3.1空质粒组作为对照。用ELISA法测定免疫鼠血清中特异性抗体IgG、IgG亚型的表达水平及细胞因子IFN-γ、IL-4的含量,MTT法测定淋巴细胞转化率,观察小鼠受攻击感染弓形虫后的存活时间。结果质粒pcROP5和pcmIL-12共免疫小鼠3次后,与pcROP5质粒单独免疫组和对照组相比,IL-12基因佐剂的共免疫提高了免疫鼠血清中特异性抗体IgG及IgG亚型IgG2a的表达水平,提高了细胞因子IFN-γ的含量,增加了淋巴细胞的转化率,但IgG1和IL-4的表达水平变化不大;攻击感染后,质粒pcROP5和pc-mIL-12共免疫组小鼠存活时间显著延长。结论弓形虫ROP5基因与基因佐剂pcmIL-12共免疫能增强对小鼠的免疫保护性。

弓形虫MIC8基因与基因佐剂IL-12共免疫小鼠的保护性研究（英文）

目的观察弓形虫MIC8基因和基因免疫佐剂白细胞介素(IL-12)共免疫小鼠所诱导的免疫保护性。方法将编码弓形虫MIC8的基因插入到真核表达质粒载体pc DNA3.1中,构建真核表达质粒pcMIC8,并转染至HeLa细胞,蛋白免疫印迹分析(Western blotting)检测重组蛋白的表达情况。80只昆明小鼠随机均分为5组,分别为对照组(PBS组、pcDNA3.1空质粒组、pcIL-12质粒组)、pcMIC8质粒组以及pcMIC8+pcIL-12质粒共免疫组。共免疫组以pcMIC8质粒和pcIL-12质粒各100μg(溶于100μl PBS)肌注昆明小鼠后腿股,共免疫3次,每次间隔2周,PBS组、pcDNA3.1空质粒组、pcIL-12质粒组和pcMIC8质粒组分别注射等量的PBS、pcDNA3.1空质粒、pcIL-12质粒和pcMIC8质粒,同法免疫。免疫前及初次免疫后13 d、27 d、41 d和55 d,用ELISA测小鼠血清中抗体IgG和IgG2a的表达水平。末次免疫后4周,ELISA法测各实验组小鼠脾细胞培养液上清中γ干扰素(IFN-γ)和IL-4的表达水平。末次免疫后3周,各组小鼠腹腔注射接种103弓形虫RH株速殖子,观察小鼠受攻击感染后的存活时间。结果 Western blotting显示,重组质粒pcMIC8能在HeLa细胞中表达,蛋白相对分子质量(M r)约为74 000。初次免疫后55d,共免疫组小鼠血清IgG(0.51±0.028)、IgG2a(0.261±0.04)抗体水平高于pcMIC8质粒组(0.409±0.031、0.159±0.031)和对照组(P<0.05),lgG1抗体在各实验组之间未见有显著差异。末次免疫后4周,共免疫组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ含量(1083.27±925.34)显著高于pcMIC8质粒组(497.65±98.15)和对照组(PBS 47.18±2.73,pcDNA3.1 50.08±4.62,pcIL-12 118.15±12.73)(P<0.05);各组IL-4的水平差异无统计学意义(P>0.05)。攻击感染后,共免疫组小鼠存活时间(15 d)较pcMIC8组(10 d)和对照组(PBS 5d,pcDNA3.1 6d,pcIL-12 8d)显著延长(P<0.05)。结论弓形虫MIC8基因与基因佐剂IL-12共免疫小鼠能增强其免疫反应。

香蕉束顶病毒海南分离物DNA2编码区的克隆及抗血清的制备

利用PCR方法克隆香蕉束顶病毒海南分离物(Banana bunchy top virus,BBTV-HN)DNA2编码区,将其插入到原核表达载体pGEX-6p-1谷胱苷肽-S-转移酶(GST)基因下游。所得克隆pGEX-HN-B2测序结果表明,插入的DNA2片段为267bp,且表达相位和理论上设计的完全一致。把此重组质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)中,经过异丙硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后出现约33Ku融合蛋白质表达条带。为获得特异的血清,切下目的表达条带并免疫兔子。经Western-blotting检测,获取的血清可以和表达的33Ku融合蛋白特异结合,表明已成功获得DNA2编码蛋白的血清。

香蕉束顶病毒研究进展

香蕉束顶病毒(Bananabunchytopvirus,BBTV)是引起香蕉束顶病害(Bananabunchytopdisease,BBTD)的病毒,它严重地危害了香蕉的生产。综述了近年来香蕉束顶病毒的分离提纯方法,株系划分以及分类地位,较为全面的介绍了BBTV病毒基因组分结构和各组分编码蛋白的功能等,并提出了目前需要进一步澄清的问题。

病毒编码基因介导的植物病毒抗性机理研究进展

根据植物自身病毒编码基因的不同,重点介绍了其病毒抗性机理的研究进展。

16S rRNA测序鉴定一株感染实验小鼠的表皮葡萄球菌

目的:应用16SrRNA测序及序列分析方法来鉴定一株来自实验室饲养小鼠的细菌。方法:对可疑小鼠的血液进行细菌培养,革兰氏染色观察细菌菌株的表型,PCR扩增菌株16SrRNA并进行测序,将测序序列与GenBank数据库的菌株序列进行进化树和基因距离分析。结果:本研究鉴定的菌株为革兰氏阳性表皮葡萄球菌。结论:16SrRNA基因测序鉴定细菌的方法适用于非专业研究人员;实验动物也可能含有病原体,进行动物实验时要有防护措施。

辣椒叶脉斑驳病毒研究进展

综述辣椒叶脉斑驳病毒(ChiVMV)的生物学特性、基因组、检测方法等方面的研究进展,并针对国内外当前研究中存在的问题作了相关讨论和展望。

不同纯度的有机溶剂对2株肿瘤细胞的抑制作用

目的给脂溶性的抗肿瘤药物筛选高溶解性、低细胞毒性的有机溶剂。方法采用MTT法,按照不同纯度,对8种能溶于水的有机溶剂,测试其对黑色素瘤B16、人胃癌细胞SGC-7901两种细胞株的细胞毒性。结果不同有机溶剂对不同细胞株的抑制皆不同,甲醇与丙酮对两种细胞株的毒性相对都较弱,纯度越高的有机溶剂对细胞毒害越小。结论光谱纯的甲醇与丙酮是脂溶性抗肿瘤药物有效的有机溶剂。

大肠埃希菌JM109表面抗原Ag43基因敲除与鉴定

目的敲除大肠埃希菌JM109表面抗原43(Ag43)基因并对其进行鉴定。方法采用Sigma公司的TargeTron基因敲除系统和Ag43基因特异设计的PCR引物扩增获得突变Ⅱ组内含子RNA蛋白复合体(RNP)基因序列,然后将这段基因序插入表达RNP的质粒pACD4K-C中,获得Ag43特异的重组RNP质粒pACD4K-Ag43。最后将pACD4K-Ag43转化JM109,经过IPTG诱导表达将Ⅱ组内含子插入Ag43特异的部位。结果通过软件分析发现插入Ⅱ组内含子的最佳位点位于碱基1 812和1 913之间,琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的突变Ⅱ组内含子RNP基因序列分子量大小和预期值(350bp)相一致,用NheⅠ和HindⅢ二种酶切分析重组质粒pACD4K-Ag43结果和预期值相符,PCR扩增相应产物和基因测序显示Ⅱ组内含子特异地插入Ag43基因碱基序列的1 812/1 913位点。结论成功地将大肠埃希菌JM109中的基因敲除,为更进一步深入研究Ag43基因的功能和将其作为制备重组Ag43嵌合蛋白的宿主菌奠定了基础。

Ag43/GFP嵌合表达质粒的构建及其在大肠杆菌表面的表达

目的构建大肠杆菌抗原Ag43(p ETAg43')以及Ag43和绿色荧光蛋白(GFP)(p ETAg43'/GFP)的重组表达质粒,了解p ETAg43'/GFP是否能够将GFP表达于细菌表面。方法用PCR扩增获得Ag43大部分基因序列(Ag43'),同时用酶切方法从质粒p EGFP-C1切取GFP基因序列,首先将Ag43'基因序列插入表达质粒p ET-22b中,获得重组质粒p ETAg43',然后再将GFP基因序列插入p ETAg43'获得质粒p ETAg43'/GFP。将重组质粒p ETAg43'/GFP转化Ag43基因缺失的菌株JM109(△Ag43),用荧光显微镜和SDS-PAGE了解是否能将GFP表达于细菌表面,同时了解加热是否能够直接获得Ag43'/GFP的嵌合重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的Ag43'和GFP基因序列分子量大小与预期值相一致,酶切分析重组质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP结果与预期值相符,基因测序显示质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP的基因序列和阅读框架均准确无误。质粒p ETAg43'/GFP经诱导后可以将Ag43'/GFP嵌合蛋白表达于大肠杆菌JM109(△Ag43)的表面,55℃加热50 min是提取Ag43'/GFP嵌合蛋白的最佳条件。结论成功构建了能够将外源蛋白GFP表达于细菌表面的重组表达载体,在大肠杆菌表面有效表达并加热提取获得了嵌合重组蛋白Ag43'/GFP,为制备其他自身抗原分子的Ag43嵌合蛋白奠定了基础。

以Endoglin为靶点的新型免疫偶联物的抗肿瘤作用

目的观察抗Endoglin(END)单克隆抗体与阿霉素(ADM)偶联物的抗肿瘤作用。方法采用MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)为交联剂制备END-ADM偶联物,MTT法测定其在体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用,以小鼠肝癌H22细胞皮下移植瘤模型观察其在体内抑制肿瘤生长的效果。结果等细胞毒性剂量的偶联物END-ADM与ADM对体外培养的肝癌细胞杀伤作用差异不大。动物实验中ADM 0.4mg/kg对H22肝癌的抑制率为29.33%,而等细胞毒性剂量的END-ADM偶联物的抑瘤率达到86.67%,抑制作用显著增强(P<0.05),与ADM相比,偶联物还可显著延长荷瘤小鼠的中位生存时间(P<0.05)。结论 END-ADM偶联物对小鼠肝癌H22细胞皮下移植瘤的抑制作用比ADM显著增强,可能成为新型的抗肿瘤靶向药物。

鱼泡草总黄酮治疗特应性皮炎的研究

目的研究海南鱼泡草总黄酮(total flavonoids of Jussiaea repens,TFJ)对小鼠慢性皮炎的治疗作用。方法用不同浓度二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB)反复刺激昆明小鼠皮肤致敏后,灌胃给药不同剂量的TFJ。再通过H&E染色检测皮肤组织病理学变化,ELISA检测血清总Ig E和IL-2含量变化,RT-PCR检测皮肤细胞因子Eotaxin-1/CCL11和LARC/CCL20的m RNA表达。结果通过TFJ和氢化可的松治疗后,TFJ能减轻鼠耳肿胀度,减少肥大细胞数及浸润炎症细胞数,并且能降低小鼠血清中升高的Ig E水平、升高血清中降低的IL-2水平,同时降低趋化因子配体基因Eotaxin-1/CCL11和LARC/CCL20的m RNA表达。结论 TFJ能有效抑制小鼠慢性皮炎。

加强海南生态环境建设,实现可持续发展

从海南生态环境的现状出发,阐述海南生态省建设与可持续发展的关系,提出海南生态环境建设的若干建议。

小果酸浆总苦味素对慢性皮炎的治疗作用及机制研究

目的:探讨海南小果酸浆总苦味素(Total Physailins of Physalis minima,TPPM)对小鼠慢性皮炎/湿疹的防治作用。方法:采用5%二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB)外涂于小鼠背部致敏,5天后用0.1%DNCB于小鼠右耳内侧反复激发,每周3次,共5周,引起慢性皮炎模型,给药组于激发后涂抹TPPM。结果:用药5周后,TPPM能明显减轻鼠耳肿胀度,减少结痂动物数及浸润炎症细胞数,且能降低小鼠血清中升高的IgE水平以及升高血清中降低的IL-2水平。结论:TPPM能有效抑制小鼠慢性皮炎、湿疹,其作用机制可能与降低IgE水平以及升高IL-2水平有关。

家兔葡萄球菌病的诊断及治疗

家兔是对葡萄球菌病最敏感的一种动物,近几年,我们在几个养兔场对兔葡萄菌病进行了诊治,其中有转移性脓毒症21例(皮肤型17例,内脏型4例),仔兔脓毒败血症12例,脚皮炎8例。通过细菌学的检验和药敏试验为今后防治家兔葡萄球菌病提供参考。

朝阳市大平房防洪堤优化设计

大平房防洪堤于1995年(阎王鼻子水库主体设计)完成初步设计书并已经批复。现阎王鼻子水库大坝主体已竣工,防洪堤的修建已迫在眉睫。由于原设计较仓促,本次优化对坝体稳定进行了详细设计,泵站中的泵型选用当前科技含量高的先进泵型。外围排水又进行了方案比较并论证。同时又结合了原设计中老虎山河左侧1.1km旧堤及甲乙两排水站的泄洪洞。通过计算,优化后比优化前降低造价69.32万元。

阎王鼻子水库电站增容可行性研究

阎王鼻子水库建成后,城市工业用水没有达到设计水平年用水水平,且灌区配套工程也没有同步建成,水库非汛期弃水较多,资源浪费较大。本文建议电站增加一台500 kW机组,从而提高水库水能资源的利用程度。