沙蚕丝氨酸蛋白酶家族相关基因的克隆和测序

①目的 从海洋生物双齿围沙蚕消化道上皮细胞中获得编码丝氨酸内肽酶某一功能基因的克隆。②方法 以丝氨酸内肽酶高度保守位点设计引物 ,利用 5′cDNA末端快速扩增 (5′RACE)和 3′RACE的方法 ,分别获得该保守位点前后的片段 ,克隆、测序。③结果 获得一条长度为 5 12bp编码丝氨酸内肽酶相关基因的序列。

儿童下呼吸道人类博卡病毒感染的病毒载量和疾病严重程度相关性研究

目的研究下呼吸道感染患儿人类博卡病毒(HBoV)载量与疾病严重程度的相关性。方法对2009年1月至2012年9月间554例因下呼吸道感染住院的5岁以下患儿及195名健康对照组儿童下呼吸道吸出物(NPAs)、鼻咽拭子采用荧光聚合酶链反应(PCR)检测HBoV种类,并同时测定阳性标本感染HBoV的载量,利用商品化试剂盒检测其他种类的呼吸道病毒,结合患儿的临床症状和生化指标进行综合分析。结果实验组与健康对照组HBoV阳性率有明显差异,实验组病毒载量(5.10×106拷贝/mL)明显高于对照组(2.70×103拷贝/mL,P<0.05)。实验组中混合感染组疾病严重程度为一般和中等的患儿HBoV载量(分别为2.70×105、3.85×106拷贝/mL)明显低于严重患儿(8.70×106拷贝/mL,P<0.05)。在1例新生儿重症肺炎患儿NPAs、血液和粪便中均检测到HBoV,并排除了其他常见呼吸道病毒和细菌感染。结论 HBoV是呼吸道疾病致病病原,混合感染中HBoV载量与疾病严重程度呈正相关,HBoV在某些患儿中可以导致重症肺炎。

共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应在呼吸道副黏病毒科病毒诊断中的应用

采用共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应(CODEHOP PCR)体系和商品化RV12试剂盒对急性呼吸道感染患儿下呼吸道标本中的副黏病毒科病毒进行检测,比较CODEHOP PCR与RV12试剂盒检测结果的符合率和敏感度,观察CODEHOP PCR在临床呼吸道标本中对副黏病毒诊断的应用价值,进一步探讨具备检测已知呼吸道病毒和未知新病毒特点的CODEHOP PCR在呼吸道疾病谱和未知潜在呼吸道病毒诊断中的推广价值。采集2011年上海市儿童医院因急性呼吸道感染住院的患儿下呼吸道标本572份,分别采用2种方法对副黏病毒进行检测。CODEHOP PCR检测出阳性标本113例,阳性率为19.76%;RV12试剂盒检测出阳性标本102例,阳性率17.83%;2种方法检测符合率为85.39%。以10倍倍比稀释呼吸道合胞病毒A(RSVA)感染的细胞收获液,检测结果显示,CODEHOP PCR和RV12试剂盒检测下限分别为10-8和10-6。CODEHOP PCR具备简便、易操作和测序精度高等特点,适合疾病预防系统和临床检验科使用。该方法与一些新兴的高通量快速分子诊断技术结合,可提高检测灵敏度,具有高通量、快速检测和筛查未知新病毒的优势,在呼吸道病原体检测领域值得进一步优化和推广。

SARS病毒的组织嗜性和宿主趋向性

①目的 了解SARS病毒的组织嗜性和宿主趋向性。②方法 分别将具有明确致病性的 2 2种冠状病毒 (包括 6株SARS病毒 )S蛋白编码序列和 2 2种冠状病毒全基因序列 (包括 1 1株SARS病毒 )进行对排并绘制系统发生树 ,观察具有不同组织嗜性和宿主范围的冠状病毒所处的位置 ,预测SARS病毒的组织嗜性和宿主趋向性。③结果 在依据编码S蛋白序列和全基因序列所绘制的系统发生树中各冠状病毒的分支明确 ,与其在美国国立医学图书馆 (NCBI)中的分类相一致。④结论 SARS病毒是冠状病毒的一个新的变种 。

油松成熟胚总RNA的提取方法

[目的]对油松成熟胚总RNA的提取方法进行比较,以期得到完整的高质量油松成熟胚RNA。[方法]以油松成熟胚为材料,用SDS法、Trizol法和CTAB法及改良的SDS法对油松成熟胚总RNA进行提取,以紫外分光光度计测OD值,并用琼脂糖凝胶电泳检验提取效果。[结果]改良SDS法提取的RNA产率高,完整性好,A260/A280为1.97,A260/A230为2.08,28 S、18 S、5 S条带清晰且28 S亮度是18 S的2倍。通过RT-PCR检测,ds cDNA片段的弥散带分布范围在0.3～3.0 kb,进一步验证改良的SDS法可获得高质量的RNA,用于后续的分子生物学研究。[结论]改良SDS法成本低,操作简单,提取时间短,RNA质量好,是多酚多糖植物总RNA提取比较有效的方法。

上海市儿童下呼吸道感染常见病毒诊断方法比较

目的应用直接免疫荧光法(DFA)和多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对呼吸道感染患儿鼻咽分泌物的常见病毒进行检测,比较2种方法的符合率并评估其临床应用价值。方法选取急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物540例,分别用DFA和多重RT-PCR进行检测,分析其结果。结果 DFA检测阳性率为43.9%(237/540),多重RT-PCR检测阳性率为55.7%(301/540),多重RT-PCR阳性检出率显著高于DFA的阳性检出率(χ2=29.093,P<0.01)。DFA和多重RT-PCR同时阳性163例,DFA阳性而多重RT-PCR阴性74例,多重RT-PCR阳性而DFA阴性138例,DFA和多重RT-PCR同时阴性165例。DFA和多重RT-PCR同时为阳性的163例标本中,有15例标本两者检测结果不一致,符合率为91.0%。结论 DFA快速、简便、特异性及敏感性高,适用于临床检测。多重RT-PCR的敏感性高,检测病毒谱广,且可以做亚型鉴定,适用于呼吸道病毒流行病学的调查。

SYBR GreenⅠ实时PCR检测乙脑病毒方法的建立与初步应用

目的建立一种快速、特异的SYBR GreenⅠ实时PCR方法检测流行性乙型脑炎（乙脑）病毒。方法对SYBR GreenⅠ实时PCR检测乙脑病毒方法的反应条件、反应体系进行优化,同时与传统RT-PCR方法进行灵敏度比较,提高该方法的特异性、灵敏性。并用该方法对乙脑病毒毒株、登革病毒（Ⅰ-Ⅳ型）毒株、90份猪血清标本进行检测。结果SYBR GreenⅠ实时PCR与传统RT-PCR检测乙脑病毒方法的灵敏度无明显区别,但检测时间缩短了1/2。该方法可检测出乙脑病毒,不能扩增登革病毒,对90份猪血清标本检测结果均为阴性。结论建立的SYBR GreenⅠ实时PCR方法用于乙脑病毒检测具有特异、灵敏、快速等优点,可用于乙脑的病原学监测。

猪乙脑病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

目的建立检测猪血清中流行性乙型脑炎病毒(JEV)IgG抗体的间接免疫荧光试验(IFA)。方法用乙脑病毒感染C6/36白蚊伊蚊细胞制备抗原片,建立检测猪血清中JEV-IgG抗体的IFA方法,并用于猪乙脑血清流行病学调查。结果成功建立特异的猪JEV-IgG的IFA检测方法,并对50份母猪、55份仔猪和65份屠宰猪的血清进行检测。乙脑血清抗体效价≥1:200的分别为88.00%,10.91%和24.62%。结论建立的IFA方法能较好的用于猪血清乙脑流行病学调查。

26肽蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白的原核表达、纯化及活性测定

在E .coliDH5α中表达 2 6肽蜂毒素与基因变构人白细胞介素 2的嵌合体蛋白 ,并进行初步纯化和抗原性检测。利用剪接式重叠延伸 (splicedoverlapextension ,SOE)技术在 2 6肽蜂毒素与基因变构IL 2的基因之间导入四个易形成空间结构的氨基酸残基组成的连接肽 (Gly4Ser) 3 ,构建嵌合体蛋白的基因 ,克隆到原核表达载体pGEX4T 2中 ,重组质粒转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达目的融合蛋白 ,纯化蛋白经Thrombin酶切后进行SDS PAGE与Western blot鉴定。

基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测

目的从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白。方法提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA。根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。根据该序列利用5′RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达。表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性。结果cDNA经5′RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×103);重组pMAL-p2表达出51.0×103的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性。结论从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物。

IL-21编码基因的克隆及其在大肠杆菌中表达

①目的 利用基因工程技术从人扁桃体细胞cDNA中克隆出白细胞介素 2 1(IL 2 1)的编码基因 ,并在大肠杆菌中进行表达。②方法 以人扁桃体细胞经PHA刺激的cDNA文库为模板 ,经PCR获得IL 2 1的全基因片段。测序确认后 ,分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物 ,经PCR获得IL 2 1成熟肽的编码基因。将此IL 2 1基因插入表达载体 pGEX4T 2 ,重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α进行IPTG诱导表达。 ③结果 琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒的PCR和双酶切产物与理论值的大小相等。SDS PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α亦表达一与理论相符的条带。目的蛋白约占总菌体蛋白的 10 %。④结论 成功地构建了IL 2

基因变构IL-2重组克隆的构建

①目的 构建基因变构IL 2 (88ArgIL 2 )的重组克隆。②方法 将正常人的扁桃体细胞经PHA刺激后 ,获得cDNA文库 ,并以此为模板 ,经套式PCR扩增得IL 2的基因编码序列。测序确认正确后 ,设计含有突变位点的引物 ,经PCR定点诱变技术获得变构IL 2克隆并进行序列测定。③结果 IL 2基因定点诱变成功 ,并获得了基因变构IL 2重组克隆。④结论 IL 2重组基因变构克隆的构建为进一步在原核和真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL

2006年上海监测点婴幼儿腹泻标本中诺如病毒基因分析

[目的]了解2006年上海监测点婴幼儿病毒性腹泻散发病例中诺如病毒基因型别及核酸变异情况。[方法]应用一步法RT-PCR扩增89份病毒性腹泻标本中诺如病毒核酸,测序后应用基因分析软件包对核酸序列进行分析。[结果]12条核酸序列经测序和比对均属于诺如病毒GII基因组,其中3条核酸测序序列与2006年德国公布的序列同源性相近;其余9条核酸测序序列与2004年中国、2004、2005年日本、2006年荷兰公布的序列同源性相近。[结论]2006年上海地区婴幼儿中存在诺如病毒GII基因组散发病例,并以GII4基因型为主。

SYB GRreenⅠ实时PCR检测甲肝病毒方法的建立与初步应用

目的:建立一种快速、特异的SYBR GreenⅠ实时PCR方法检测甲肝病毒。方法:对SYBR GreenⅠ实时PCR检测甲肝病毒方法的反应条件、反应体系进行优化,同时与传统RT-PCR方法进行灵敏度比较,提高该方法的特异性、灵敏性。并用该方法对甲肝病毒毒株、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(1～6型)毒株、贝类水产品标本进行检测。结果:SYBR GreenⅠ实时PCR与传统RT-PCR检测甲肝病毒方法的灵敏度无明显区别,但检测时间缩短了1/2。该方法能特异检测出甲肝病毒,不能扩增脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(1～6型)毒株,对农贸市场40份贝类水产品进行甲肝病毒核酸检测,检出3份。结论:建立的SYBR GreenⅠ实时PCR方法用于甲肝病毒检测具有特异、灵敏、快速等优点,可用于甲肝的病原学监测。

汉滩病毒截短核蛋白在大肠杆菌中的表达及其初步应用

利用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)从急性期HFRS病人外周血清总RNA中扩增获得汉坦病毒S片段部分编码基因 (SA) ,使用NCBIBlast软件对排分析证实为汉滩型 ,申请GenBank号 :AY42 5 61 2。将该片段克隆入原核表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达。所表达的蛋白分子量约为 490 0 0kDa,重组蛋白在菌体中主要以包涵体形式存在。Western blot分析表明该核蛋白具有较好的抗原活性。该蛋白在肾综合征出血热 (HFRS)

上海地区部分婴幼儿腹泻标本中诺如病毒基因分析

目的了解2006年上海哨点医院婴幼儿疑似病毒性腹泻散发病例中诺如病毒基因型别和基因特征。方法应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增标本中诺如病毒核酸,测序后使用DNAstar基因分析软件与Genbank中的参考株进行核酸序列分析。结果13份测序结果均属于诺如病毒GⅡ遗传组,以GⅡ.4基因型为主。其中2份核酸序列与2006年德国汉堡毒株序列同源性相近,分别为86.2%和88.2%;2份核酸序列与2006年荷兰乌得勒支毒株序列同源性相近,均为83.9%;其余9份核酸序列与2004年中国广西、2004年和2005年日本东京毒株序列同源性相近,为87.3%～97.5%。结论2006年上海哨点医院婴幼儿疑似病毒性腹泻标本中存在诺如病毒GⅡ.4基因型散发病例,不同病毒株之间差异较大。

人3型腺病毒快速实验室检测方法的建立

[目的]为不明原因的呼吸道感染疾病的诊断提供一个新的筛选检测方法。[方法]建立一套针对人Ad3型腺病毒的PCR检测方法并应用该方法对人Ad3型腺病毒进行灵敏度、特异性的试验。[结果]通过对提取的Ad3型腺病毒DNA定量测定,该建立的方法可检测到pg级的人Ad3型腺病毒DNA,PCR扩增产物为一条特异的502 bp条带。[结论]建立的快速检测人Ad3型腺病毒的方法大大改善了用细胞培养的不便,不仅缩短了检测时间,而且提高了检测的灵敏度。

反转录聚合酶链反应检测水产品中甲型肝炎病毒的研究

目的:建立一种特异、灵敏的RT-PCR方法检测水产品中甲肝病毒。方法:采用抗体捕获RT-PCR和直接RNA提取RT-PCR对细胞传代的甲肝病毒、模拟染毒水产品中甲肝病毒、上海农贸市场水产品中的甲肝病毒进行检测。结果:2种RT-PCR检测细胞传代的甲肝病毒,检测灵敏度无明显区别;而对模拟染毒水产品中甲肝病毒的检测,两者检测灵敏度有显著差异。对农贸市场94份水产品中的甲肝病毒检测,检出率分别为2.13%、13.83%。结论:对于水产品中的甲肝病毒的检测,直接RNA提取RT-PCR要比抗体捕获RT-PCR方法灵敏。

应用Super SMART cDNA合成技术扩增油松胚珠总RNA

以油松雌性不育突变体和具有相似遗传背景可育系的胚珠为材料,用Plant RNA assistant kit试剂盒提取油松总RNA,采用Super SMART cDNA合成技术合成cDNA第l链,优化扩增第2链,通过设置梯度PCR扩增循环数,电泳分析后鉴定cDNA质量,采用定量法评估其扩增效率。可育系和不育系各1μg总RNA分别成功扩增出46.06和43.59μg纯化的双链cDNA,质量及纯度较高。此方法的应用解决了研究材料有限的问题,可由微量的胚珠总RNA扩增出足够多的高质量双链cDNA,为今后抑制性消减杂交文库的构建奠定基础。