多药耐药铜绿假单胞菌耐药性及相关耐药基因分析

目的探讨临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌耐药性及相关耐药基因。方法采用纸片扩散法进行药敏试验,VITEK 2全自动微生物鉴定及药敏系统对其进行重新鉴定,聚合酶链反应(PCR)扩增oprD2、金属酶基因、氨基糖苷类酶修饰基因。结果 40株铜绿假单胞菌对临床常用的抗生素:厄它培南,亚胺培南(IPM)、头孢他啶(CAZ)、美罗培南、头孢吡肟(PEP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、环丙沙星、氨曲南(ATM)、庆大霉素(GEN)、妥布霉素、阿米卡星、多粘菌素耐药率分别为100%、96.2%、92.0%、90.1%、84.8%、83.9%、83.1%、73.7%、65.1%、60.6%、58.0%、0%。PCR结果显示oprD2缺失率65.0%,整合子阳性率22.5%,发现金属酶基因IMP-1株,氨基糖苷类修饰酶基因ant3Ⅰ、aac6Ⅱ、aac6Ⅰ、ant2Ⅰ基因阳性率分别为36.0%、35.1%、26.2%,20.1%,同时携带2种或2种以上耐药基因占55.0%,携带2种以上氨基糖苷类修饰基因的有40.0%。结论多重耐药铜绿假单胞菌耐药性高,携带多种氨基糖苷类修饰酶基因,外膜孔蛋白oprD2缺失在多药耐药铜绿假单胞很常见,另外携带多种耐药基因盒的整合子的存在也是细菌耐药的常见原因,应引起高度重视。

2011—2016年铜绿假单胞菌耐药性变迁分析

目的分析2011—2016年间铜绿假单胞菌分离株的耐药性及变迁情况,为临床合理用药提供科学依据。方法对2011年1月—2016年12月广州市第一人民院患者各类标本中分离到的铜绿假单胞菌2 257株进行细菌鉴定及药敏试验,并对耐药性变迁进行统计分析。结果铜绿假单胞菌在痰液标本中的检出率最高为56.9%;6年铜绿假单胞菌平均耐药率以妥布霉素最低,为9.9%,对哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、左氧氟沙星、环丙沙星、亚胺培南、庆大霉素等药物的耐药率均<20%,在2013年耐药率最低,此后三年逐年上升。结论铜绿假单胞菌对广州市第一人民院常用抗生素的耐药率在近3年呈逐年上升趋势,临床医师应根据药敏结果合理选择抗菌药物,以提高疗效和减缓耐药菌的产生。

2007～2010年铜绿假单胞菌感染分布及耐药性变迁分析

目的研究2007～2010年铜绿假单胞菌感染分布及临床分离株对常用抗菌药物耐药率的变迁,为临床合理使用抗铜绿假单胞菌药物提供依据。方法对2007～2010年该院住院患者临床标本分离出的株铜绿假单胞菌株分布、耐药情况进行统计分析。药敏试验采用K-B纸片扩散法。结果铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药率从2007～2009有普遍性逐年增高的趋势,2010年较2009年有所下降,但均较2007～2008年高。对头孢他啶的耐药率由2007年的24.5%增至2009年40.5%,但2010年降至33.2%;亚胺培南的耐药率由2007年的22.0%增至2009年46.2%,2010年仍然高达45.2%;哌拉西林/他唑巴坦的耐药率从2007年的10.7%增至2009年的33.6%,但2010年降至27.1%;对阿米卡星的耐药率最低,但从2007至2009年也呈上升趋势,分别为3.4%和29.5%,2010年仍高达23%。结论铜绿假单胞菌是医院感染的常见条件致病菌,其耐药问题已十分突出,应严格限制抗菌药物的使用,对铜绿假单胞菌感染的治疗,可首选哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、环丙沙星、亚胺培南等,联合阿米卡星为较优化的组合治疗方案。

真菌性医院获得性肺炎52例的临床特点

目的:探讨近年来真菌性医院获得性肺炎发病的易患因素、临床特征、治疗及预后。方法:收集广州市第一人民医院2007年6月—2009年6月真菌性肺炎52例的临床资料,并对其分析。结果:92.7%真菌性医院获得性肺炎患者均患有较严重的基础疾病,87.8%患有两种或两种以上基础疾病,其中以慢性阻塞性肺疾病、肺炎、糖尿病、血液系统疾病多见,其易发因素为长期使用广谱抗生素、糖皮质激素及免疫抑制剂、气管插管/气管切开及呼吸机辅助通气、低蛋白血症,临床表现多不典型,痰培养以念珠菌最多,占61.5%,其中白色念珠菌占38.4%,且多合并革兰阴性菌感染,占51.9%。结论:真菌性医院获得性肺炎是多种疾病继发感染的重要原因,其临床表现不典型,病死率高,发病呈上升趋势,应引起临床高度重视。

测序法筛选慢性阻塞性肺疾病尼古丁受体CHRNB4基因外显子单核苷酸多态性

目的:寻找中国南方汉族人群尼古丁受体(CHRNB4)基因功能区与慢性阻塞性肺疾病(COPD)疾病相关的单核苷酸多态性位点(SNP)。方法:在广州地区抽取按照慢性阻塞性肺疾病全球创议(GOLD)诊断标准(扩张后FEV1/FVC<70%)确诊的汉族COPD患者120例,按年龄(±3岁)与病例频数匹配原则选取非COPD对照者120例,病例组来自广州医科大学附属市一人民医院住院及门诊患者,对照组来自门诊志愿者。抽取受试者外周血提取基因组DNA,利用Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)查寻CHRNB4的全基因组序列,以Oligo6引物设计软件设计包括全外显子序列在内的测序引物5对,焦磷酸法DNA测序,Bio Edit分析软件对测序序列进行比对及基因分型分析。结果:通过第一代测序,快速筛选出中国汉族人群CHRNB4外显子区3个SNP,分别为rs56218866、rs6743072、rs1948。其中rs56218866可引起氨基酸位点改变。结论:通过第一代测序,可以简单、快速筛选出中国南方汉族人群与尼古丁受体CHRNB4外显子功能区和COPD易感性相关的SNP位点。

不动杆菌致下呼吸道感染70例临床特点及其药敏分析

目的:分析不动杆菌下呼吸道感染的临床特点和监测不动杆菌对常用抗生素的药物敏感性。方法:回顾性分析广州市第一人民医院2002年1月-2003年12月不动杆菌致下呼吸道感染70例的临床资料,从痰标本中分离所得70株不动杆菌,并采用K-B法进行药敏监测。结果:所有病人均患有较严重的基础疾病,曾反复使用一种或多种抗生素,48.6％有混合感染。药敏监测结果表明,不动杆菌对泰能最为敏感,达98.5％,对替卡西林+克拉维酸、头孢哌酮+舒巴坦及喹诺酮类抗生素环丙沙星亦有较好的抗菌活性,对β-内酰胺酶类抗生素头孢噻肟、哌拉西林及单环类如氨曲南有较高的耐药性。结论:不动杆菌致下呼吸道感染多有较严重的基础疾病,病情复杂,应及时选择敏感的抗生素治疗如加β-内酰胺酶抑制剂的半合成青霉素类治疗,必要时可改亚胺培南治疗。

一种有效的体外连接法构建heNOS重组腺病毒

目的:探讨一种新的有效的体外连接方法构建重组腺病毒转移载体。方法:将目的基因heNOS(人内皮型一氧化合酶)亚克隆到穿梭质粒pShuttle启动子CMV的下游,再通过I-Ceu Ⅰ和PI-Sce Ⅰ两个稀有酶切位点,将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得含目的基因heNOS重组腺病毒质粒DNA,后者经限制性内切酶Pac Ⅰ切割后,两端露出反向末端重复序列(ITR),利用脂质体转染293细胞,获得含目的基因重组腺病毒上清。PCR双引物检测含有目的基因heNOS片段。结果:PCR双引物检测含有目的基因heNOS片段,表明利用体外连接法成功构建了含目的基因heNOS重组腺病毒转移载体。结论:体外连接法是一种有效的复制缺陷型重组腺病毒构建方法。

人eNOS复制缺陷型重组腺病毒的构建

目的构建以巨型细胞病毒(CMV)为启动子的heNOS重组腺病毒转移载体。方法和结果将heNOScDNA全长亚克隆到穿梭质粒启动子CMV的下游,通过ICeuⅠ和PISceⅠ两个稀有酶切位点将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdenoX)进行体外连接,获得重组腺病毒质粒DNA(pAdenoheNOS),后者经限制性内切酶PacⅠ切割,利用脂质体转染法获得heNOS重组腺病毒。PCR双引物法鉴定是否成功构建heNOS重组腺病毒。结论PCR双引物检测含有heNOS片段,表明成功构建了heNOS重组腺病毒转移载体AdhCMVheNOS。

heNOS基因在小鼠肺内的表达

目的观察人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)重组腺病毒感染小鼠肺组织后heNOS基因在小鼠肺组织内的表达。方法采用反转录PCR(RT-PCR)法克隆heNOS基因,利用体外连接法构建复制缺陷型heNOS重组腺病毒表达载体;免疫组织化学分析heNOS在小鼠肺组织内的表达情况。结果(1)序列分析表明,克隆所得heNOS基因片段含有完整开放阅读框架,与GenBank中heNOS cDNA序列(*163729)同源性达99.93%。(2)该基因在转染细胞中能表达具有生物活性功能的NOS蛋白。(3)体外连接法成功构建出复制缺陷型heNOS重组腺病毒转移载体。(4)滴入heNOS重组腺病毒后,小鼠肺血管内皮细胞、平滑肌细胞、细支气管上皮细胞内heNOS阳性表达明显增加。结论本实验成功构建的复制缺陷型heNOS重组腺病毒转移载体,能经呼吸道转移至肺组织,并在小鼠肺血管、支气管和肺泡上皮细胞表达所需的目的蛋白heNOS。

定点突变法构建人尼古丁受体α5亚单位突变体(Asn398)慢病毒表达载体

目的:克隆人尼古丁受体α5亚单位(CHRNA5),以野生型CHRNA5为模板,通过定点突变法构建CHRNA5突变体(Asn398)慢病毒真核表达载体,为Asn398功能研究提供基础。方法:RT-PCR克隆CHRNA5基因片段,运用重叠延伸PCR法进行定点突变,定向克隆至EX-Q0146-LV201,序列分析鉴定野生及突变重组子,将CHRNA5突变体Asn398及未突变体定向克隆到EX-Q0146-LV201慢病病毒表达质粒上。并转染至HEK293T细胞中,RT-PCR检CHRNA5 mRNA表达,Westernblot检测其蛋白表达。结果:重组子目的基因的序列分析结果显示成功克隆CHRNA5 cDNA基因,并成功将CHRNA5第398位氨基酸天冬氨酸(Asp)转变为天冬酰胺(Asn),突变体及未突变在转染细胞中均获得CHRNA5 mRNA及蛋白表达。结论:成功构建CHRNA5突变体Asn398慢病毒表达载体,证实其在293细胞中有mRNA转录及其蛋白表达,为下一步进行功能研究奠定基础。

肺炎克雷伯杆菌致大鼠重症肺炎模型的改良与评估

目的:采用肺炎克雷伯杆菌标准菌株感染SD大鼠,建立大鼠重症肺炎模型,探讨重症肺炎动物模型诊断标准。方法:取25只大鼠随机分成对照组、观察组和模型组,其中对照组和观察组各5只,模型组15只。通过气管内注射的方式,模型组和观察组分别接种相同剂量不同浓度的肺炎克雷伯杆菌菌液,对照组接种生理盐水。动态观察大鼠行为学、体温、体重、肢端血氧饱和度(SaO2)、外周血象和动脉血气变化,观察肺组织病理改变和胸部X线检查变化等。对照组和观察组在术后72 h处死存活大鼠,模型组在达到预定的诊断标准后处死。结果:大鼠用无创血氧饱和度仪检测得到的数值与有创动脉血气分析中SaO2的数值基本一致;与观察组比较,模型组行为学变化、体重变化、肺组织病理改变和胸部X线检查明显加重,外周血象、SaO2和动脉血气变化存在明显差异(P<0.05);对照组各项观察指标在手术前后无明显变化。结论:注射高浓度菌液可以建立重症肺炎动物模型,预定的诊断标准对判断动物重症肺炎模型成功与否有一定的指导作用;无创动脉血氧饱和度仪可以用于监测大鼠SaO2变化。

支气管镜检查在疑诊肺结核痰菌阴性患者中的诊断价值

目的分析支气管镜检查对临床怀疑肺结核而痰涂片结核菌阴性患者的诊断价值。方法回顾性分析459例于2010年6月-2015年5月临床和影像学怀疑肺结核但痰涂片阴性的患者。所有患者连续3 d痰涂片阴性或者无痰者均接受电子支气管镜检查,包括刷检、支气管肺泡灌洗(BAL)和经支气管肺活检,标本分别进行涂片抗酸染色、结核菌培养或组织病理检查。结果 459例临床怀疑肺结核痰菌阴性患者,经支气管镜检查可以明确诊断者378例,占82.4%。378例支气管镜确诊病例中,肺结核238例(占63.0%),其他诊断包括支气管肺癌、非特异性炎症、机化性肺炎、肺部真菌感染、间质性肺炎、结节病和非结核分枝杆菌感染。在支气管镜确诊的病例中,涂片(毛刷和/或BAL液)阳性156例,诊断灵敏度57.95%;BAL液培养阳性213例,诊断灵敏度79.78%;病理活检阳性152例,诊断灵敏度56.93%。支气管镜综合技术(涂片+培养+活检)的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为91.01%、97.46%、97.98%和88.89%。结论对临床表现和影像学怀疑肺结核而痰涂片结核菌阴性的患者,支气管镜检查对肺结核的诊断具有良好的临床价值,可作为常规检查加以推广。

纸片扩散法与微量肉汤稀释法检测鲍曼不动杆菌对替加环素体外敏感性的比较

目的比较微量肉汤稀释法和纸片扩散法对耐药饱曼不动杆菌替加环素敏感性试验检测结果。方法收集临床分离的非重复鲍曼不动杆菌42株,其中MDR菌株11株,XDR菌株31株,采用微量肉汤稀释法和纸片扩散法进行替加环素药物敏感性试验,比较检测结果的符合性。结果微量肉汤稀释法检测替加环素的敏感率、中介率和耐药率分别为97.6%、2.4%和0%,MIC500.5μg/mL,MIC902μg/mL。纸片扩散法药敏检测,不同药敏折点替加环素的敏感率从高到低依次为:Jones标准为28.6%,Kulah C标准为16.7%,FDA标准为2.4%,3种折点标准的中介率都很高,在45.2%～61.9%之间。与微量肉汤稀释法比较,不同药敏折点标准的总误差分别为Jones标准71.4%,Kulah C标准83.3%,FDA标准97.6%。以抑菌环直径≥12 mm作为敏感折点时总误差最小。结论耐药鲍曼不动杆菌的替加环素药敏检测中,纸片扩散法与微量肉汤稀释法之间存在差异,稀释法仍是首选检测手段,如只能行纸片法检测,建议以抑菌环直径≥12 mm判定为敏感。

血清CEA联合CA125,CA199及CA153检测在肺癌诊断中的价值

目的探讨血清癌胚抗原(CEA)、糖链抗原125(CA125),199(CA199),153(CA153)及联合测定对肺癌诊断的临床应用价值。方法应用电化学发光法测定92例肺癌患者、64例肺部良性疾病患者血清CEA,CA125,CA199,CA153水平,并对其诊断价值进行评价。结果肺癌患者血清中CEA,CA125,CA199,CA153的水平均有不同程度地升高,与对照组比较差异有显著性(P<0·01)。血清CEA联合CA125,CA199,CA153检测的灵敏度、特异度、准确度较血清CEA单项检测高(P<0·01)。结论临床检测血清CEA,CA125,CA199,CA153的水平有助于肺癌诊断的筛查及肺癌的鉴别诊断,多项联合检测可提高肺癌诊断的准确性。

肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制研究

目的研究肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药机制。方法采用浓度梯度法（Etest）测定细菌对各种抗菌药物最低抑菌浓度，聚合酶链反应（PCR）扩增β-内酰胺酶基因，并对扩增产物进行基因测序，用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）进行外膜蛋白（OMP）分析。用抑制试验进行主动外排机制检测。结果4株菌株全部携带有SHV-12型和DHA-1型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因，3株携带CTX-M-14型ESBLs基因；4株菌外膜蛋白分析发现，肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药株与敏感株相比，缺少分子量在32500-47500之间的一条带，从位置判断该条带可能为OMP36000或OMP37000的一种外膜蛋白；主动外排检测全部为阴性。结论同时产多种β-内酰胺酶合并外膜蛋白缺失可能是导致本组肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药的原因。

血清淀粉样蛋白A、干扰素-G诱导蛋白10及降钙素原在AECOPD中的诊断意义

目的:评价血清血清淀粉样蛋白A(SAA)、血清干扰素G诱导蛋白10(IP-10)及降钙素原(PCT)在慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者中的诊断价值。方法:(1)选取AECOPD患者60例,s COPD患者52例,对照组28例,构成随机平行资料。(2)另随机选择其中19例AECOPD患者及其稳定期构成COPD急性加重-稳定期配对资料。采用酶联免疫法测定各组患者血清标记物水平,比较并分析其异同。结果:(1)AECOPD组SAA浓度与s COPD组SAA浓度差异有统计学意义(P<0.05)。(2)AECOPD组与s COPD组血清IP-10浓度比较有统计学差异(P<0.05)。(3)AECOPD组与s COPD组血清PCT浓度比较无统计学差异(P>0.05)。结论:AECOPD组血清SAA和IP-10浓度较s COPD组升高,有助于AECOPD的诊断,其诊断敏感度及特异度分别为100.0%、54.9%,96.1%、75.0%。本研究结果中PCT不能用于鉴别AECOPD与s COPD。

鲍曼不动杆菌常用药物敏感性试验方法之间的差异比较

目的:比较鲍曼不动杆菌抗生素敏感性试验全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK-2、纸片扩散法与微量肉汤稀释法检测结果之间的差异。方法:收集2011年4月至2012年2月临床分离的非重复鲍曼不动杆菌42株,采用微量肉汤稀释法、纸片扩散法和(或)VITEK-2药敏分析系统对临床常用的头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、多西环素、阿米卡星及替加环素这5种抗生素进行敏感性试验,比较后者检测结果与微量肉汤稀释法的符合性。结果:以微量肉汤稀释法作为参考,利用VITEK-2系统检测时,总误差分别为阿米卡星85.7%,亚胺培南14.3%;利用纸片扩散法检测时,总误差分别为替加环素71.4%,头孢哌酮/舒巴坦26.2%,多西环素19.0%,阿米卡星14.3%,亚胺培南11.9%。结论:鲍曼不动杆菌的药敏检测中VITEK-2系统和(或)纸片扩散法药敏与微量肉汤稀释法之间存在差异,微量肉汤稀释法仍是首选检测手段。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶和oprD2基因的检测

目的:了解我院临床分离下呼吸道感染的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPA)oprD2基因和金属β-内酰胺酶(MBL)的分子流行病学情况。方法:铜绿假单胞菌的鉴定和药敏采用VITEK-2系统进行药物的最低抑菌浓度(MIC)检测。应用双纸片增效法和聚合酶链反应(PCR)方法检测其产MBL的表型及相关的oprD2基因、IMP型和VIM型金属酶基因。结果:157株亚胺培南铜绿假单胞菌对多种抗菌药物的耐药率均在40%以上,经双纸片增效法筛选出20株MBL阳性(12.7%),经PCR方法检测20株MBL阳性株中有13株IMP型基因阳性,oprD2基因有67株阳性,其余90株缺失(57.3%),未发现VIM型基因。有10株IRPA既携带IMP型基因同时又有oprD2基因缺失。结论:我院临床分离下呼吸道感染的耐亚胺培南铜绿假单胞菌呈较严重的多重耐药。IMP型基因是我院IRPA产MBL的主要基因型;oprD2基因缺失可能是铜绿假单胞菌亚胺培南耐药的重要原因之一。

鲍曼不动杆菌多位点序列分型与抗生素耐药表型的关系

目的对鲍曼不动杆菌菌株进行分子流行病学分型及耐药性分析,为临床防控提供指导。方法收集非重复鲍曼不动杆菌42株,采用多位点序列分型(MLST)进行分子流行病学分型,e BURST分析菌株亲缘性,纸片扩散法进行药敏试验。结果 42株鲍曼不动杆菌被分为10个ST型,其中ST195及ST208最常见,占总数的69.0%,e BURST分析提示主要流行克隆为CC92。根据纸片药敏结果,菌株对多黏菌素B的敏感性最高为100%,其余抗生素的敏感率均小于30%,42株菌株可分为多重耐药(MDR)菌株11株,广泛耐药(XDR)菌株31株。优势克隆CC92与非CC92的MDR、XDR菌株的比例差异无统计学意义(P=0.676)。结论鲍曼不动杆菌CC92广泛流行,CC92与非CC92菌株的耐药性无差别,CC92的成功流行可能更依赖于对医院环境的高度适应性。

老年与中青年肺结核临床特点比较

目的:探讨老年及中青年肺结核各自的临床特点,针对老年肺结核的特殊性,提出相应的诊断策略。方法:选择89例60岁以上老年肺结核患者及同期住院60岁以下中青年肺结核患者124例,从肺结核临床表现、痰菌检查、胸部X线特点、并发症等方面进行比较。结果:两组临床表现各有特点,结核菌检查结果差异无显著性,X线胸片特征及病灶类型不同,并发症发生情况差异有显著性。结论:老年肺结核临床症状不典型、发病率逐年上升、并发症多、易误诊、痰涂片找结核杆菌阳性率高,是重要的传染源之一,故临床医师应掌握老年肺结核的临床特点,早诊断,早治疗。