厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

强化厌氧表达dld基因以提高大肠杆菌工程菌发酵产L-乳酸的光学纯度

为去除廉价发酵原料中的D-乳酸从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度,该研究通过构建带有不同厌氧诱导启动子(pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB)的D-乳酸脱氢酶基因(dld)的表达质粒,并将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)HBUT-L,加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。通过装液量与转速的单因素试验筛选最优的质粒表达条件及菌株,并在无机盐培养基与玉米浆培养基中进行发酵验证。结果表明,在装液量为200 mL/250 mL、转速为150 r/min的条件下,含有启动子pflBp6-pnirB的表达质粒的工程菌株HBUT-L4发酵18 h时D-乳酸脱氢酶活力最高,为81.1 U/g。在此条件下进行无机盐培养基和玉米浆培养基发酵时,工程菌株HBUT-L4相对于出发菌株HBUT-L,D-乳酸消耗速率分别提高250%、217%,L-乳酸的光学纯度分别从96.32%、98.48%提升至99.95%、99.98%。在大肠杆菌工程菌发酵L-乳酸的过程中,带有厌氧诱导启动子pflBp6-pnirB的表达质粒可提高D-乳酸脱氢酶活力,强化菌株消除外源D-乳酸,进而提高L-乳酸的光学纯度的能力,具有重要的工业化应用价值。

构建大肠杆菌合成生物群落利用混合糖同步发酵生产L-乳酸

目的:实现大肠杆菌混合糖发酵产L-乳酸过程中对葡萄糖-木糖的同步利用。方法:以L-乳酸工程菌大肠杆菌JH16(E.coli B,△frdBC△pflB△ackA△adhE,ldhA::ldhL)为出发菌株,通过RED同源重组技术敲除木糖转运及代谢基因xylFGH、xylE和xylA,获得不能利用木糖的菌株大肠杆菌JH16031。以大肠杆菌JH2705(E.coli JH16,△ptsG△mglB)为出发菌株,敲除葡萄糖转运及代谢基因crr、malX和galP,获得不能利用葡萄糖的菌株大肠杆菌JH27071,以构建大肠杆菌合成生物群落。通过摇瓶和5 L发酵罐试验确定该合成生物群落在混合糖发酵时较优的混合接种比例。结果:以60 g/L葡萄糖和40 g/L木糖为碳源进行发酵,当JH16031与JH27071初始接种比为1∶50,初始OD_(600nm)=0.5,混合糖的利用率最高,在84 h内消耗97%的糖,并在96 h内结束发酵。葡萄糖消耗速率为705 mg/(L·h),木糖消耗速率为435 mg/(L·h),L-乳酸产率为951 mg/(L·h),L-乳酸产量达到92 g/L,糖酸转化率为91%。结论:构建大肠杆菌合成生物群落可实现利用混合糖发酵产L-乳酸过程中葡萄糖和木糖的同步利用。研究结果为工业发酵生产中,使用低成本的木质纤维素为原料,降低发酵成本,提高混合糖利用率提供技术支持。

重组大肠杆菌全细胞转化苹果酸合成丙酮酸

拟建立一条以苹果酸为原料,通过大肠杆菌全细胞转化获得丙酮酸的合成途径。以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,在pET28a上共表达内源的苹果酸酶(ME)和来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的醛糖还原酶(AR),并对细胞浓度、底物浓度、温度和pH值等催化关键因素进行研究。共表达后大肠杆菌苹果酸酶和博伊丁假丝酵母醛糖还原酶酶活分别为(2.8±0.21),(3.1±0.34)U/mL。适宜的催化条件为:细胞浓度OD600nm值为30,底物苹果酸质量浓度为30 g/L,木糖和苹果酸物质的量比为1.0,温度为40℃,反应体系pH值为7.8,丙酮酸产量最高可达23.16 g/L。本研究为生物法合成丙酮酸提供了一种新的方法。

高光学纯度L-乳酸工程菌的构建及其蔗糖发酵

本研究以可利用蔗糖发酵产D-乳酸的工程菌WD 206为出发菌株(ΔcscR,ΔadhE,ΔfrdBC,Δpta,ΔpflB,Δal-dA),敲除D-乳酸脱氢酶基因(ldhA),并插入乳酸片球菌pediococcus.acidilactici的L-乳酸脱氢酶基因(ldhL),以构建L-乳酸工程菌WL306。该菌在60h的发酵过程中,可将100g/L的蔗糖转化生成81.92g/L的乳酸,产率为82%,在发酵产物中占99.5%;L-乳酸的光学纯度高达99.9%。该结果说明此工程菌具有生产高纯度L-乳酸的工业开发潜力,为采用廉价碳源材料(甘蔗渣,糖蜜)生产打下良好基础。

基于智慧旅游的中低端酒店发展与供给侧改进研究——以青海省为例

根据第三次全国经济普查数据资料,结合实地调研,对青海省中低端酒店的发展现状与特征、市场需求、消费趋势等进行分析的基础上,查找供需双方差距,在此基础上,站在供给侧角度,认为青海中低端酒店发展需要秉承分级分类的发展思路,具体是"一档酒店亲民化、二档酒店连锁化、三档酒店升级化",进一步从硬件改造、人力资源建设和加强市场营销力度三方面提出具体的发展措施。

青海湖二郎剑景区旅游解说系统效度与优化策略

随着大众旅游时代的到来,旅游解说系统发挥着越来越重要的作用,其解说效度的高低成了评价景区服务的重要指标。文章在论述青海省5A级景区青海湖二郎剑景区旅游解说系统现状的基础上,围绕"向导式"和"自导式"解说,从"重要性"和"满意度"两个维度来体现该景区旅游解说系统的解说效度,就并"重要性"分值相对偏高,同时"满意度"相对偏低的旅游解说项目提出优化策略。

聚丙烯非织造布表面的紫外光固化改性

为了改善聚丙烯(PP)非织造布的亲水性能,提高水通量,通过照射紫外光(UV)引发自由基聚合法,使丙烯酸树脂与HEMA在PP非织造布表面发生交联聚合反应,进行紫外光固化亲水改性。研究了亲水单体和光引发剂的浓度以及紫外光照射时间对聚丙烯非织造布亲水性能的影响。利用红外光谱和扫描电镜对改性PP非织造布表面的化学组成和形貌结构进行表征,通过接触角和水通量分析了改性后PP非织造布的亲水性和耐久性。结果表明,当丙烯酸树脂与HEMA的质量比为2∶1、固含量占亲水改性溶液总量的20%、光引发剂184的含量为2%、光照时间为15 s时,达到改性后PP非织造布的最优亲水性能,接触角由初始的126°下降至42°,水通量由5543 L/(m^(2)·h)提升至6035 L/(m^(2)·h),并且,具有良好的耐久性。

青海旅游资源的“多维”开发

青海旅游资源十分丰富,类型多样,但在旅游资源的开发利用方面一直滞后于国内外同类型地区的开发利用,文章通过梳理在现阶段青海旅游资源开发需坚持的理念,即"可持续"、"品牌化特色化"、"联动"、"以市场为导向"和"智慧"开发理念.提出青海旅游资源的多维开发理念,即时间维度、空间维度和类型维度,重点就时间维度展开论述,以期从时间角度更好的开发大美青海旅游资源.

基于生态文明新常态下的青海旅游资源多元保护

青海旅游资源十分丰富,类型多样,但由于多方面原因,在旅游资源的保护方面一直滞后于国内外同类型地区。文章通过综合不同类型旅游资源的保护路径,在借鉴他人优秀经验成果的基础上,提出青海旅游资源多元保护的理念,即限制式保护、分区式保护、集中式保护和分散式保护。最后主要从政府层面、旅游资源管理环境评估、法律法规建设、生态意识强化、全面质量管理、人才队伍建设及解说系统的完善等方面提出青海旅游资源可持续发展的建议。

政府作用下“大美青海”旅游品牌建设成效

在青海省政府领导下,各级政府相关部门紧密团结,以"建设高原旅游名省"为目标,强力推进"大美青海"旅游品牌建设.论文通过系统梳理"大美青海"旅游品牌的建设步骤和建设内容两方面的具体成效,旨在夯实"大美青海"旅游品牌建设基础.

论生态文明新常态下青海自然生态环境对民族村寨传统文化的影响

一般而言,自然生态环境是人类生产生活活动的基础,生产生活活动是文化产生的基础;有什么样的生存环境就有什么样的生产生活活动,有什么样的生产生活活动就产生什么样的文化。因此,青海独特的自然生态环境是其民族村寨传统文化之基。水既是载舟之基,亦是覆舟之因,因此,自然生态环境既是青海民族村寨传统文化产生的基石,也是其被破坏的原因。通过梳理青海民族与其文化及青海自然生态环境的基础上,从积极和消极两个层面来探讨自然生态环境对青海民族村寨传统文化的影响。

红酵母利用玉米浆发酵产富含类胡萝卜素功能饲料的研究

研究旨在对红酵母D(Rhodotorula sp.D)利用玉米浆发酵生产含类胡萝卜素功能饲料的培养基的碳氮源进行优化,并进行工业化生产试验。对玉米浆和葡萄糖结晶废糖液分别进行单因素试验来确定最佳碳氮源比例,进行7 L发酵罐试验确定上罐参数,1 000 L发酵罐中试并对发酵液进行喷雾干燥制取产品。结果表明葡萄糖结晶废糖液和玉米浆的添加量分别为7%和33.3%,7 L发酵罐最佳发酵时间为72 h,此时的生物量、色素含量和色素产量分别达到30.2 g/l,374.1μg/g和11.3 mg/l;1 000 L最佳发酵时间为41 h,此时的菌体生物量,色素含量,色素产量分别为42 g/l,404.6μg/g,17 mg/l。喷雾干燥后的产品粗蛋白质含量达到31%,类胡萝卜素含量为180.4μg/g。结果表示,优化培养基组分,控制好发酵条件,就可以利用玉米浆发酵生产富含类胡萝卜素红酵母增色功能饲料。

高产琥珀酸重组大肠杆菌的构建及厌氧发酵

以野生型大肠杆菌Escherichia coli W为出发菌株,利用Red同源重组系统分别敲除了乳酸脱氢酶基因(ldhA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)和乙酸激酶基因(ackA),再通过无氧生长进化筛选过程,构建得到在厌氧条件下能有效生长,并以琥珀酸为主要发酵产物的重组大肠杆菌WS100(△ldhA,△adhE,△pflB,△poxB,△ackA)。利用15 L发酵罐进行厌氧发酵测定显示,经72 h发酵,菌体密度OD600最大值可提高至6.48,琥珀酸产量达到70.13 g/L,琥珀酸的生产强度为0.98 g/(L.h),葡萄糖-琥珀酸转化率为76%。发酵液中副产物含量低,乙酸含量为5.34 g/L,乳酸产量仅为0.15 g/L,未检测到甲酸和乙醇生成。结果表明,厌氧条件下,该工程菌可有效利用低营养成分的无机盐培养基,在不表达任何外源基因的条件下可稳定高产琥珀酸,具有极大的工业化开发前景。

基于打造国际生态旅游目的地的青海旅游人才培养路径

打造“国际生态旅游目的地”是着眼新的时代背景,为青海文化旅游发展确立的新坐标、描画的新蓝图、指明的新路径,是推动青海文化旅游业未来发展的基本遵循和行动纲领。青海文化旅游高质量发展急需要 “高精尖缺”的专业领军人才,更需要数量庞大、基础扎实的基层人才。文化旅游人才需求数量庞大,涉及行业类型复杂多样,不同行业类型人才的培养模式各有特点。基于青海省打造国际生态旅游目的地背景,结合专业教学、科学研究和社会服务的经验,就青海文化旅游人才培养路径进行研究,即通过壮大人才队伍、提升师资学历职称水平、加强国际交流合作、积极引进领军人才和培养急需师资等方式来加强师资队伍建设;通过搭建学科交叉平台、开展跨校院系合作、完善“专升本”“本升硕”的人才培养路径的方式来提升人才培养质量;最后,通过分阶梯课程建设、现有课程融入相关思政元素、科研成果融入课堂教学、拓宽全球视野深化实践教学等方式来促进以一流本科专业建设为引领的专业课程建设。

青海湖景区旅游解说系统建设现状及建议

旅游解说对旅游者来说，可以帮助旅游者顺利完成游览活动，提升旅游体验的质量，同时，它对提高旅游服务水平，提升旅游地形象具有重要意义。本文以青海湖景区为例，通过对其旅游解说系统的调查研究，指出目前在旅游解说系统建设中存在的问题，并提出了解决对策和建议。

重组大肠杆菌利用不同培养基发酵产琥珀酸的研究

微生物发酵法生产琥珀酸具有广阔的应用前景,实验针对实验室构建的工程菌Escherichia coli WS100(△ldhA、△adhE、△pflB、△poxB、△ackA)在不同培养基中进行厌氧发酵,考察其发酵特性。分别采用NBS培养基和玉米浆培养基,在含4L发酵液的发酵罐中进行补料-分批发酵。发酵83h后,Escherichia coli WS100在玉米浆培养基中消耗葡萄糖96.17g/L,积累琥珀酸63.45g/L,生产强度和质量收率分别为0.76g(/L·h)和65.98%;Escherichia coli WS100在NBS培养基中消耗葡萄糖110.30g/L,琥珀酸的产量达到84.98g/L,生产强度和质量收率分别为1.02g(/L·h)和77.04%。实验结果表明,Escherichia coli WS100在玉米浆培养基和NBS培养基中发酵均有较高的琥珀酸产量,其中在NBS培养基中琥珀酸的产量、生产强度和质量收率均比在玉米浆培养基中高。

西宁市旅游公共交通服务现状及优化

当旅游成为一种生活方式时,以往的团队出行方式已逐渐减少,取而代之的是自助游、散客游,此时旅游目的地公共交通服务的完善对旅游者对该地区的满意度起到决定作用。作为青藏高原旅游集散地,西宁市成为各类自驾游、自助游旅游者的首选之地,但由于公共交通服务的不完善给来西宁旅游者带来诸多不便。论文选取旅游交通服务较主要的三个方面展开研究分析,通过查阅该领域他人的研究成果和实地走访调查,对西宁市旅游公共交通服务建设现状及存在问题进行分析,并给出建设西宁市公共服务体系的建议。

重组大肠杆菌利用木糖发酵产高纯度L-乳酸

对重组大肠杆菌JH16利用木糖产高纯度的L-乳酸进行研究。通过无氧管驯化Escherichia coli JH12菌株得到E.coli JH16,驯化后的菌株菌体浓度提高了31%,乙酸积累减少了43%;在摇瓶中考察不同Mg2+浓度对E.coli JH16产L-乳酸的影响,确定最适Mg2+质量浓度为0.25 g/L;E.coli JH16以60 g/L木糖为C源,在7 L全自动发酵罐中添加0.25 g/L Mg2+,乳酸积累量提高了18%,达38.18 g/L,乳酸纯度高达95%;E.coli JH16在30 g/L木糖和30 g/L葡萄糖混合C源中,优先利用葡萄糖,当葡萄糖质量浓度低于1.56 g/L后,菌体开始利用木糖进行乳酸发酵,最终得到39 g/L乳酸。

D-乳酸大肠杆菌工程菌的驯化及其补料发酵研究

以前期构建的D-乳酸大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌LHY02为出发菌株,通过在乳酸盐中对菌株进行驯化的方式来解除乳酸根对菌体的抑制作用;采用葡萄糖分批补加方式缓解高含量葡萄糖的阻遏效应,拟进一步提高大肠杆菌发酵产D-乳酸的产量、生产强度和糖酸转化率。结果表明,驯化后的菌株LHY201在16%的葡萄糖发酵中D-乳酸产量比驯化前提高了36.7%。LHY201结合葡萄糖进行补料发酵(补料方式为8%+8%+4%),乳酸产量、发酵时间、糖酸转化率以及生产强度分别为185.7 g/L、48 h、93.8%、3.87 g/L/h,D-乳酸光学纯度达到99.6%,相比一次性添加20%葡萄糖的分批发酵,乳酸产量和糖酸转化率分别提高了21.1%和21.2%,发酵周期缩短了一半。