一类基于组效关系神经网络模型的中药药效预测方法

目的 :研究与药效相关的中药质量分析方法。方法 :分别选取非线性函数逼近能力较强的BP神经网络和径向基函数神经网络 ,并与偏最小二乘法相结合 ,建立中药组效关系模型 ,进而用组效关系模型计算预测药效 ,据此评价中药质量。结果与结论 :将其应用于川芎质量评价 ,无论在训练误差、预测误差以及相关系数等方面 ,均明显优于PCR和PLSR方法 ,具有较理想的训练及预测精度和可信度 ,能够较准确地反映川芎各化学组分与药效检测指标间复杂的非线性映射关系 ,可发展成为能反映药效的中药质量评价方法。

木香肝毒性组分筛查与GC-MS分析研究

目的:筛查中药材木香中潜在的肝毒性组分。方法:对木香25个化学组分,采用二乙酸荧光素荧光标记法在HepG2细胞模型上筛查肝毒性组分,并使用气相色谱-质谱联用仪分析其化学组成。结果:从木香中筛查出10个肝毒性组分,经气相色谱-质谱联用定性分析,C09组分的主要成分为去氢木香内酯、santamarine(或magnolialide)和reynosin,而C11组分的主要成分是α-木香醇和榄香醇。结论:木香所含的去氢木香内酯、santamarine(或magnolialide)、reynosin、α-木香醇和榄香醇可能具有肝毒性。

用于耐药肿瘤细胞代谢组学的细胞内核苷类组分离子对色谱分析法

目的:建立测定 K562及 K562/A 细胞内核苷类代谢物含量的高效液相色谱法,用于两者代谢组学研究。方法:采用1.2mol·L^(-1)HClO\-4沉淀蛋白,用苯硼酸柱进行固相萃取富集样品中的核苷酸。色谱柱为汉邦 C_(18)(4.6mm×250mm,5μm),流动相由两种缓冲液组成,梯度洗脱,流速为0.8 mL·min^(-1)。A 相缓冲液含10 mmol·L^(-1)四丁基氢氧化铵,10 mmol·L^(-1)KH_2PO_4及0.25%甲醇,pH7.0;B相缓冲液含5.6 mmol·L^(-1)四丁基氢氧化铵,50 mmol·L^(-1)KH_2PO_4及30%甲醇,pH7.0。柱温25℃,检测波长260nm。结果:各种核苷类代谢物分离良好,内源性物质无干扰,K562及 K562/A 细胞内核苷类代谢物平均回收率分别为88.3%～109.2%、84.5%～115.6%。结论:该法简便及重现性好,可同时测定肿瘤细胞中核苷、单核苷酸、二核苷酸及三核苷酸含量。分析结果表明,K562与 K562/A 细胞核苷类代谢物组存在明显差异。

一种测定天然药物活性成分的HPLC-DAD计算分析方法

将窗口因子分析所得结果作为初值,采用交替迭代进行窗口的自适应优化调整,以迭代逼近方法有效地解决了窗口选择难题.将其用于丹参中丹参酮、隐丹参酮和丹参酮A含量的HPLC-DAD分析测定,加样回收率分别达94.16%,91.57%和104.48%.计算机仿真和模拟中药物质体系的实验结果均表明,本方法分析结果受窗口偏差的影响较小,显著优于经典窗口因子分析法,可推广用于计算解析复杂样品色谱分析中出现的重叠峰.

膀胱肿瘤细胞mRNA致敏的树突状细胞体外抗肿瘤免疫反应

目的:研究小鼠膀胱癌BTT739细胞mRNA致敏的树突状细胞(DC)诱导特异性的抗肿瘤免疫反应。方法:使用rmGM-CSF和rmIL-4培养诱导小鼠骨髓细胞分化为DC,从BTT739细胞中提取mRNA致敏DC,与小鼠淋巴细胞混合培养以诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。采用MTT比色法和软琼脂法检测CTL对BTT739细胞的杀伤作用。结果:MTT比色法和软琼脂法检测结果显示:在靶细胞∶效应细胞不同浓度组中,BTT739实验组和对照组的OD值和肿瘤集落形成个数都有显著性差异(P<0 01,P<0 05),在靶细胞∶效应细胞的比例为1∶5、1∶25、1∶50和1∶100时,其杀伤率分别为25. 0%、36 .1%、45 .9% 和58 .2%;当效应细胞作用于AGS细胞时,其OD值无显著差异。结论:以膀胱肿瘤细胞mRNA致敏DC诱导CTL可有效杀伤膀胱肿瘤细胞。

幽门螺杆菌flaA基因表达载体的构建和产物免疫性的鉴定

采用高保真PCR从幽门螺杆菌Y0 6株DNA中扩增全长flaA基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 pET32a的flaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用Hp全菌抗体的westernblot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。所克隆的flaA基因核苷酸和氨基酸序列与文献报道的同源性分别为 96 .2 8%～ 97.13%和 99.4 1%～ 10 0 %。pET32a flaA BL2 1DE3系统表达的FlaA融合蛋白量高达细菌总蛋白的 4 0 %～ 5 0 %。FlaA融合蛋白能与Hp全菌抗体及家兔免疫血清发生结合反应。

丹参素大鼠体内药代动力学及生物利用度研究

目的:研究丹参素在大鼠体内药动学和口服生物利用度。方法:以随机分组组间对照实验设计方法,用超高压液相色谱三重四级杆质谱联用法测定丹参素血药浓度,用topfit软件计算药动学参数,在12只SD大鼠(两组)体内研究单剂量灌胃或静脉注射46 mg.kg-1丹参素后的药动学参数和口服生物利用度。结果:灌胃组大鼠的Cmax为(1 419±439)ng.mL-1,tmax为(60.1±19.0)min,t1/2为(138.9±42.2)min,AUC为(2.01±0.40)×105ng.min.mL-1,静脉注射组大鼠的t1/2为(159.9±77.2)min,AUC为(2.11±0.55)×106ng.min.mL-1。结论:丹参素的口服生物利用度为9.53%,口服生物利用度较差,其半衰期无明显差异。

丹参素在Caco-2细胞单层模型中的跨膜转运研究

目的:研究丹参素在Caco-2细胞模型中的跨膜转运机制。方法:通过研究丹参素在模型中的双向转运,考察时间、药物浓度及转运蛋白抑制剂对丹参素吸收的影响。用液相-质谱联用法检测药物浓度,计算其表观渗透系数。结果:表观渗透系数Papp值随时间延长而增大,到一定时间趋向饱和状态,并随丹参素浓度的增加而逐渐减小。双向转运的Papp比值即Pratio均大于1.5。在加入P-gp转运蛋白抑制剂维拉帕米后,丹参素Papp,A-B值显著增大,而Papp,B-A值显著降低。结论:丹参素在Caco-2细胞模型中的转运可能主要是由P-gp转运蛋白介导的主动转运。

中药注射液“Q-Markers”的辨析研究——丹红注射液研究实例

中药质量控制是保证中药临床用药安全性和有效性的重要措施,也是制约中药现代化进程的重要因素。由于中药的复杂性,目前的中药质量标准研究仍比较薄弱。构建符合中药特点的质量控制体系,是当前中药现代化进程中亟待解决的难题。本文以丹红注射液为例,从化学物质基础、质量标志物、质控方法 3个层次,阐述中药注射液"Q-Markers"辨析策略,为中药质量控制研究提供新思路。

基于随机森林与Chemistry Development Kit描述符的P-gp底物识别

应用随机森林方法、开放源代码软件-CDK(Chemistry Development Kit)描述符与170个化合物的训练数据集[其中96个为磷糖蛋白(P-gp)底物],建立了P-gp底物的识别模型.研究了CDK描述符与P-gp底物识别的关系,结果表明,原子极化性和电荷偏面积等分子属性对P-gp底物识别起到重要作用.该模型对训练集的预测正确率为99.42%;对外部测试集(42个化合物,其中24个为P-gp底物)的预测结果为P-gp底物、非底物及总测试集的识别正确率分别为87.50%,83.33%和85.71%.212个化合物数据集上的Leave-One-Out交叉验证识别正确率为77.4%.

前列康治疗前列腺增生的研究进展

近年来，药物治疗良性前列腺增生（BPH）逐渐成为主要的治疗手段。目前临床上抗BPH药物分为以下几类：5α还原酶抑制剂、肾上腺素能α1受体拮抗剂和植物性药物等。

液相色谱—质谱联用导向的黄葵胶囊肾保护活性物质研究

目的:本研究旨在发现黄葵胶囊肾保护活性物质。方法:采用组分制备结合液相色谱—质谱联用(LC/MS)导向筛选技术,快速发现黄葵胶囊中具有肾保护活性的物质,在盐酸阿霉素损伤HK-2细胞模型上验证其活性,并检测这些活性物质对损伤HK-2细胞中丙二醛(MDA)含量、ATP含量、线粒体耗氧率的影响。结果:筛选发现黄葵胶囊中四个组分具有肾保护活性,运用LC/MS分析推测出15个黄酮类化合物,其中鉴定出金丝桃苷、杨梅素、槲皮素、芦丁和异槲皮素五个化合物。验证结果表明,金丝桃苷、杨梅素、槲皮素、芦丁对损伤HK-2细胞的保护作用呈一定的量效关系,均能降低损伤细胞MDA含量、升高ATP含量、提高线粒体耗氧率,其中金丝桃苷能降低MDA含量,槲皮素和芦丁能升高ATP含量,杨梅素能提高线粒体耗氧率。结论:金丝桃苷、杨梅素、槲皮素、芦丁可能是黄葵胶囊中潜在的肾保护活性物质,其保护作用可能与抗脂质过氧化、减轻线粒体损伤有关。

参麦注射液保护氧化损伤心肌细胞线粒体的机制研究

目的:探究参麦注射液对氧化损伤心肌细胞的保护作用及其对线粒体能量代谢过程的影响。方法:采用叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导构建H9c2心肌细胞氧化损伤模型。分别采用MTT法和化学发光法检测参麦注射液对细胞存活率和ATP水平的影响;采用Clark氧电极检测参麦注射液对细胞有氧呼吸速率的调节作用;采用ELISA法检测丙酮酸及丙酮酸脱氢酶(PDH)的含量及活性;采用蛋白质印迹法检测丙酮酸脱氢酶亚基(PDHA1)含量;采用实时定量RT-PCR检测丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1) mRNA的表达。结果:与氧化损伤模型比较,参麦注射液可有效提高心肌细胞存活率和ATP水平(均P<0.01),提高细胞氧呼吸速率,减少丙酮酸含量,并提高PDH活性(P<0.05或P<0.01)。在分子水平上,参麦注射液可提高PDHA1蛋白表达(P<0.05),并具有降低PDK1 mRNA表达的趋势(P>0.05)。结论:参麦注射液可有效保护氧化损伤心肌细胞,其机制可能与提高PDH活性、减少丙酮酸堆积,从而维持线粒体功能稳定和细胞能量代谢稳定有关。

一种基于荧光图像的体外抗肿瘤药物快速筛选方法

目的:建立一种基于荧光成像的抗肿瘤药物体外快速筛选系统。方法:①采用二乙酸荧光素(FDA)标记测定活细胞数法,评价26个乌药组分对的体外抗肿瘤活性,并对本方法的线性范围和精密度进行了考察;②在活性筛选结果的指导下,应用LC/MS对样品进行分析,初步推断药效活性物质。结果:①该方法在细胞密度为0～10 000/孔的范围内荧光强度与细胞个数线性相关(r2=0.9858),板内的精密度为9.41%;②在26个乌药组分中,筛选得到两个抗肿瘤活性较强的组分C13和C15,抑制率均达到90%以上。结论:本方法快速、稳定、简便、线性范围宽,可用于从复杂中药组分中快速筛选抗肿瘤活性物质。此外,根据LC/MS分析结果并结合文献报道,推断乌药中具有抗肿瘤活性的化合物为异波尔定碱。

冠心宁片中水溶性组分的抗血栓活性研究

目的:使用转基因斑马鱼模型筛选冠心宁片中具有抗血栓活性的组分及药效物质,并探讨其作用机制。方法:将斑马鱼胚胎分为对照组、造模组、给药组及阳性药组,使用苯肼诱导血栓模型。通过荧光显微成像结合血红蛋白染色对冠心宁片各组分抗血栓作用进行定性和定量分析。进一步探寻活性组分中起抗血栓作用的主要成分。最后进行活性氧(ROS)检测及脂质氧化损伤丙二醛(Malondialdehyde,MDA)分析,探讨其抗血栓机制。结果:实验结果显示冠心宁片水溶性组分可显著减少外周血红细胞聚集(P<0.01),增加回心血量,且效果呈剂量依赖性。因多糖为冠心宁片水溶性成分中的主要物质,进一步实验发现丹参多糖和川芎多糖也具有抗血栓活性,且能显著降低斑马鱼的氧化应激水平,丹参多糖还具有下调胚胎脂质过氧化水平的作用。结论:丹参多糖和川芎多糖为冠心宁片水溶性组分中具有抗血栓作用的活性化合物,可能与其抑制氧化应激作用有关,具有开发为抗血栓治疗先导物的潜在应用前景。

三叶糖脂清DPP-4抑制成分筛选及其调控JNK/AKT信号通路改善胰岛素抵抗的机制研究

[目的]筛选三叶糖脂清中二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)的抑制成分,探讨三叶糖脂清及其DPP-4抑制成分对胰岛素抵抗(insulin resistant,IR)细胞的影响和作用机制。[方法]运用课题组前期建立的DPP-4抑制成分筛选方法,从三叶糖脂清中筛选DPP-4抑制成分,并对抑制率大于50%的化合物进行量效考察,通过高浓度胰岛素诱导BNL.CL2小鼠胚胎肝细胞构建IR细胞模型。通过检测葡萄糖消耗量、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平和锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)含量,考察三叶糖脂清总提取物及其DPP-4抑制成分对IR的BNL.CL2细胞的影响。以Western blot检测超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phospho-c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化蛋白激酶B(phospho-protein kinase B,p-AKT/PKB)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT/PKB)的蛋白表达。[结果]三叶糖脂清中筛选出6个化合物对DPP-4的抑制率大于50%,且在10～50μmol·L^(-1)浓度范围呈良好的量效关系。三叶糖脂清总提取物及其DPP-4抑制成分隐丹参酮能促进BNL.CL2细胞葡萄糖消耗和Mn-SOD的表达,抑制IL-1β、IL-6的分泌,降低JNK蛋白磷酸化,促进AKT蛋白磷酸化和SOD2蛋白表达。[结论]三叶糖脂清中含有DPP-4抑制作用的成分,三叶糖脂清总提取物及其成分隐丹参酮可能通过降低氧化应激和炎症反应水平来调节JNK/AKT通路,改善IR。

基于多指标抗炎活性检测的注射用血塞通生物评价方法研究

[目的]建立基于抗炎活性检测的血塞通批次间一致性生物评价方法。[方法]采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激骨髓来源巨噬细胞向M1型极化,以M1型巨噬细胞为细胞模型,以一氧化氮(nitric oxide,NO)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)以及高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)分泌量作为抗炎活性指标,考察血塞通抗炎活性的量效关系,找出其中主要的抗炎活性成分,并检测24个正常批次和4个异常批次血塞通样品的抗炎活性。[结果]血塞通能够剂量依赖性降低M1型巨噬细胞NO、IL-6以及HMGB1分泌量,人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd能显著抑制NO、IL-6以及HMGB1分泌,是其主要抗炎活性物质。24个正常批次血塞通样品对NO、IL-6、HMGB1分泌的平均抑制率分别为(75.47±7.68)%、(78.34±8.07)%、(45.84±8.45)%,而异常批次抑制率明显低于正常批次。综合多个指标初步建立了血塞通批次间一致性的生物活性评价标准,为批次间一致性评价提供了新方法。[结论]基于抗炎活性检测的血塞通生物评价方法,能够快速检测其抗炎有效性,可用于批次间生物活性的一致性评价。

双色荧光染色筛查潜在肝毒性物质方法的建立

[目的]建立一种基于荧光显微成像技术的潜在肝毒性物质体外快速筛查方法。[方法]采用荧光染料TMRM和Hoechst 33342分别标记HepG2细胞的线粒体和细胞核,在细胞荧光显微成像平台上分别采集两种荧光信号,考察双色荧光染色法的稳定性、线性动态范围,同时选用肝毒性和无肝毒性药物验证方法的可靠性,并将考察结果与经典的MTT法相比较。[结果]两种荧光的荧光强度值在平均荧光强度值的3个SD范围内波动,具有较好的稳定性;荧光强度值与细胞接种数量之间呈现良好的线性相关,R2值分别为0.9817和0.9852;双色荧光染色法考察肝毒性和无肝毒性药物的结果与MTT法基本一致。[结论]基于HepG2细胞模型的双色荧光染色法稳定、可靠,可用于潜在肝毒性药物的体外筛查。

细胞色素p4502C19基因多态性与胃癌易感性的关系

目的 :研究细胞色素 p45 0 2C19基因多态性与胃癌易感性的关系。 方法 :用PCR RFLP法对 10 0例健康对照者和 5 0例胃癌患者进行CYP 2C19等位基因多态性分组分析。结果 :胃癌患者中CYP 2C19PM发生率为2 8.0 % ,较正常对照组的 14.0 %高 ,经统计 ,两组间有显著性差异 (χ2 =4.30 ,P <0 .0 5 )。结论 :CYP 2C19PM增加了胃癌发生的危险性 ,实验结果提示CYP 2C19参与了胃癌致癌物的灭活。

100名健康人群CYP2C19基因型检测

CYP2C19又称为S—美芬妥英羟化酶,1993年Wrishton等从人类肝脏分离出来的一种酶,被发现参与十几种药物的代谢。美芬妥英羟化代谢在人群中有遗传的多态性,羟化速度快者为快代谢者(extensive metabolism EM),羟化速度慢者为慢代谢者(poor metabolism PM)。1994年de