不同种类冷冻保护剂对海带配子体及孢子的毒性评价

为筛选用于海带超低温保存的冷冻保护剂,采用10%二甲基亚砜(DMSO)、10%甘油、10%蔗糖、10%乙二醇、10%DMSO+10%甘油、10%DMSO+8%葡萄糖、10%DMSO+10%蔗糖、10%DMSO+10%甘油+8%葡萄糖、10%DMSO+10%山梨醇等9种单一或复合冷冻保护剂,在0~4℃条件下分别对海带配子体和孢子进行处理,对配子体处理30 min、60 min、24 h,对孢子处理15、30、60 min,通过统计配子体细胞的存活率以及孢子萌发成配子体的比例,对不同种类的冷冻保护剂进行毒性评价。结果表明:9种冷冻保护剂均对海带配子体和孢子有一定的毒性作用,并且毒性随着处理时间的延长而增强。10%DMSO对海带配子体细胞的毒性最小,处理60 min后配子体细胞的存活率为100%;其次是10%乙二醇,处理30 min后配子体的存活率为100%;含10%甘油的单一或复合冷冻保护剂对配子体细胞毒性较大,处理后配子体的成活率显著低于DMSO和乙二醇组(P<0.05)。单一冷冻保护剂对海带孢子的毒性显著低于复合冷冻保护剂,除10%甘油组处理30、60 min外,其他单一冷冻保护剂试验组的配子体发生率均在60%~80%。

二甲基亚砜对海带配子体克隆低温冻存的影响

以海带配子体克隆为试验对象,采用4种体积分数二甲基亚砜(DMSO)冷冻保护液,对10个品种(系)20个克隆系进行了低温冷冻保存试验。结果表明,海带配子体克隆在-80℃冻存10 d,复苏后培养,DMSO各体积分数组均有海带配子体细胞存活,其中10%和15%体积分数组冻存的20个克隆系均有存活细胞,5%和20%体积分数组仅部分克隆系有存活细胞。对于相同克隆系,10%和15%体积分数组配子体存活率高于5%和20%体积分数组。指出,在海带配子体低温冻存中,10%和15%DMSO可作为冷冻保护液,为降低成本,优选10%DMSO作为冷冻保护液。提出,经-80℃冻存的海带配子体复苏后培养,进行繁育能力验证,能正常发育,形成孢子体,低温冻存不影响其繁育能力。

大型海藻种质保存中污染的丝状真菌菌群和药敏分析

目的:通过对大型海藻种质保存中污染的丝状真菌菌群和药敏结果进行分析,为种质保存工作中预防真菌污染提供理论依据。方法:以海藻种质保存中分离的丝状真菌为研究对象,通过基因序列分析对分离的丝状真菌进行种属鉴定。并通过药敏试验选出有效抗生素。结果:分离出种质保存中污染的丝状真菌12株,主要为镰刀菌属真菌4株,占污染真菌的33.33%,枝顶孢属真菌2株,占16.67%。药敏试验结果表明,制霉菌素、两性霉素B、酮康唑、氟康唑的敏感率分别为50%、16.67%、16.67%和8.33%。伊曲康唑对分离出的12株真菌均不敏感。结论:大型海藻种质保存中污染的丝状真菌以镰刀菌属真菌为多见,制霉菌素对常见的污染真菌敏感性较高,因此可选用制霉菌素来预防大型海藻种质保存中丝状真菌的污染。

重离子束辐射对海带配子体克隆的影响

利用12C重离子束对东方海洋种质库保存的8个海带配子体克隆系进行3次辐射试验,辐射剂量分别为10、20、40、50、60、80、120、160、200和240 Gy。结果表明,使海带配子体克隆细胞发生变化的最低辐射剂量为60 Gy,随着剂量的增大,细胞死亡增多,240 Gy辐射剂量下仅有一个克隆系存活;80 Gy辐射剂量下细胞存活率约为50%~60%;不同海带配子体克隆系对重离子辐射的耐受度稍有差别;雄配子体比雌配子体耐受力稍强。

紫外线辐射对海带配子体克隆的影响

为确定海带(Saccharina japonica)配子体紫外线辐射的适合剂量范围,利用紫外线对东方海洋种质库保存的2个海带配子体克隆系进行辐射试验。通过三次预试验,辐射条件设置为:辐射距离12 cm,辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、90、120 s。结果显示:辐射时间10、20 s配子体细胞未发生明显变化,但受辐射影响,克隆约2个月的时间不生长;辐射时间30 s细胞存活率约为50%~55%;随着辐射时间的增加,细胞死亡增多;辐射时间120 s下,两个克隆系只有极个别细胞存活。在辐射距离12 cm时,辐射时间10~120 s作用范围内,雄配子体耐受力明显高于雌配子体。

海带属配子体DNA提取及ISSR-PCR体系优化

为了建立一个重现性好、稳定性高,适用于海带属ISSR遗传分析的PCR反应体系,从海带属配子体材料中提取基因组DNA作为模板,应用正交设计试验对反应体系中各因子的不同浓度进行组合优化。结果显示:适用于海带ISSR扩增反应的最佳体系(20μL)为:1×PCR buffer,1.2 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L d NTPs,1.0μmol/L ISSR引物,40 ng模板DNA,0.25 U Taq DNA聚合酶;扩增PCR程序为:95℃预变性3 min;95℃变性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,共38个循环;最后72℃延伸10 min。在优化的海带ISSR反应条件下,扩增条带稳定,重现性好,为应用ISSR分子标记技术进行海带属遗传多样性研究和分子鉴定奠定了技术基础。

海带配子体采集过程中的污染防控

海带是一种自然分布于北太平洋和北大西洋的冷水性大型经济食用海藻,自1927年从日本海域引入我国海域[1-2]之后,渐渐适应了我国的海洋环境条件,并发展成为重要的人工栽培经济海藻[3-6]。目前,我国的辽宁省、山东省、江苏省、浙江省、福建省和广东北部等沿海地区,为主要的海带养殖区域。

海带种质固相保存技术

将海带种质的无菌采集与配子体固相保存相结合,对种海带的处理、游孢子的采集、配子体的分离与固相接种等关键步骤进行了研究和改进,建立了一种高效的海带配子体固相保存方法,此方法从源头降低了细菌的污染,减少了配子体保存过程中污染细菌的机会,简化了常规固相保存的菌处理流程,提高了保种效率,有利于固相保存方法的大规模应用。

污染严重的海带配子体分离纯化

针对海带(Saccharina japonica)配子体保存过程中严重污染材料的分离纯化进行研究。(1)液相培养分离纯化法:将克隆材料经超声波细胞粉碎仪打碎后重新附着到90 mm培养皿中,利用微毛细吸管在显微镜下分离出状态好且无菌丝附着的细胞段,继续保存。(2)固相培养分离纯化法:将克隆材料4000 r/min离心5~10 min,弃上清,加灭菌PESI培养液重新悬浮藻液,利用5 mL无菌注射器吸取2 mL粉碎后的配子体细胞,逐点注射入固相平板上,接种后利用Parafilm封口膜密封培养皿,平板培养约60~120 d后观察,将未长出菌落且藻斑直径达2 mm的克隆团挑出,然后在PESI液体培养基中复苏继续保存。

植酸酶在甲壳动物饲料中的应用

从生长、营养物质消化率、酶活性等方面阐述了植酸酶应用于水产饲料中对甲壳类动物的影响,为饲料行业植酸酶制剂的添加提供参考。

海参池塘网箱保苗技术

池塘网箱保苗是通过网箱在海参养殖池塘上部水体进行保苗的一种方式。通过选择合适的池塘架设网箱,6-7月份投放10 000~20 000头/kg的小白点进行保苗,养殖成商品苗。

不同光质对多肋藻配子体生长发育的影响

以多肋藻(Costaria costata)雌雄配子体为材料,研究了蓝光、白光、红光对配子体生长发育的影响。结果表明:光质对多肋藻配子体的生长发育有显著的影响(P<0.05),雌配子体在蓝光条件下相对生长率(5.62%)显著高于红光(3.37%),但与白光下的相对生长率(4.94%)无显著差异;雄配子体在白光下的相对生长率(8.71%)最高,显著高于红光(6.73%),但与蓝光下的相对生长率(7.74%)无显著差异。相同光质条件下,雄配子体相对生长率显著高于雌配子体。整个培养周期过程中,红光条件下,配子体均未发育。相同培养天数下,蓝光组的发育率显著高于白光组。随着培养天数的增加,白光组和蓝光组的发育率均有显著的提高,白光组于第28天达到最大值21.13%,蓝光组于第20天达到最大值67.73%。

刺参、日本对虾池塘综合养殖模式试验

进行了池塘单养刺参和刺参、日本对虾池塘综合养殖对比试验，结果表明，两者刺参产量在同一时间段内差异不显著（P〉0．05）；池塘水质COD及氨氮指标差异也不显著（P〉0．05）。刺参、日本对虾池塘综合养殖模式增加效益显著。

日本大叶藻生态学研究进展

海草床具有重要生态服务功能和经济价值,其生态修复成为沿岸环境工程的重要内容之一。但日本大叶藻(Zostera japonica)的生态功能与保护在东西方科学界却倍受争议。日本大叶藻不仅在形态上与同属物种有着明显的区别,生长与繁殖具明显的纬度效应,进化出多种环境适应机制。其资源分布在太平洋两岸呈现相反趋势:在原产地,资源衰退,是重点保护物种;在北美沿岸地区,分布区域不断扩展,给当地的生态系统和经济发展带来负面影响,成为入侵物种。密切跟踪日本大叶藻资源动态、甄别其生态功能和制定科学的管理措施将成为今后研究的重点方向。

近河口海域淤泥池塘刺参养殖试验

近年来，刺参池塘养殖迅速发展，并具相当规模，但传统的石礁底质围堰养殖及改造沙砾底质的虾池进行刺参养殖已基本利用完毕，制约了刺参养殖业的进一步拓展。而在近河口海域，大片淤泥底质的虾池却没有充分利用，原因有二：一是近河口海域海水盐度相对偏低，尤其到雨季受河水径流的影响，海水盐度变化较大。二是经过前几年的对虾养殖，池底淤泥较深，污泥稀软，发黑发臭，不利于刺参的存活。

刺参养殖池塘水质理化指标的周年变化规律研究

对威海乳山市海阳所地区刺参养殖池塘的水质理化指标进行了全年跟踪监测。结果表明：池塘全年水温在-1．6-32．3℃，早8：00和下午2：00的最大温差为5．2℃；盐度27．5—32．2，仅在夏季暴雨后盐度有骤降；全年溶解氧的质量浓度在4．37-7．88mg／L，其变化趋势与水温负相关；COD在1．35—2．83mg／L，与溶解氧的变化趋势相反；氨氮的含量在0．02-0．19mg／L，1月最低，春秋季池塘定期投饵造成氨氮含量升高，全年变化趋势与温度相近。

海带基因组DNA提取方法的比较

海带是一种重要的海洋经济海藻，我国是世界上最大的海带栽培国。从上世纪五十年代至今，我国先后培育了20多个海带优良新品种（系），其应用推广促进了我国海带产业的发展。随着海带产业的迅速发展，目前的品种已不能满足生产需要。通过分子标记辅助育种方法进行品种的改良和新品种（系）的培育已经成为现在的研究热点之一。高质量的基因组DNA是进行分子遗传育种研究的前提，所以本研究采用三种不同的方法进行海带孢子体和配子体基因组DNA的提取，分别为传统方法、参考水云的方法和试剂盒法，通过比较各方法的优缺点，试验结果显示，试剂盒法适用于配子体DNA的提取，同时也适用于少量孢子体DNA的提取，若需要大量的孢子体DNA材料，则需用水云的方法大量提取DNA后，再用试剂盒中的吸附柱进行纯化。通过比较这三种方法，得到了两种材料DNA的最适提取方法，也为以后进一步研究打下良好的基础。

海黍子人工育苗研究

通过采集荣成海区成熟海黍子（Sargassummutieum），利用维尼纶绳苗帘进行了海黍子育苗试验，对育苗过程中的幼孢子体收集、清洗、泼洒以及育苗过程中的水温控制、光照强度调节等进行了研究，经过1个多月的培养，海黍子幼孢子体幼苗长至约（3．8±0．5）mm，平均密度约（16±7）株／cm2。