EPO对体外培养的神经干细胞增殖、分化和凋亡的影响

为探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对大鼠神经干细胞增殖、分化和凋亡的影响,本研究采用显微解剖、机械吹打和无血清悬浮培养方法分离培养大鼠神经干细胞,向培养基中添加不同剂量的EPO,通过计数干细胞克隆形成率、四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测法检测神经干细胞的增殖情况,用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色和激光扫描共聚焦显微镜检测细胞凋亡率;向有血清分化培养基中加入不同剂量的EPO,以神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibril-lary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色检测神经干细胞的分化情况。结果显示:与对照组相比,加入>5U/mlEPO后神经干细胞克隆形成率和MTT检测OD值明显增高,而凋亡率显著下降,分化培养后NSE阳性细胞较对照组明显增多。结果提示:EPO可促进大鼠神经干细胞的增殖,抑制其凋亡,促进其向神经元方向分化。

缺氧对离体培养神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响

为探讨缺氧对体外培养的神经干细胞生长、分化及凋亡的影响,本研究采用显微解剖、机械吹打、无血清悬浮培养方法分离培养神经干细胞,用巢蛋白(nestin)免疫荧光染色对其进行鉴定。三气培养箱予以缺氧干预,分为5%缺氧组、10%缺氧组和正常对照组,每组又依缺氧干预时间的不同,分为6、12、24、48、72、96和120h组。通地绘制细胞生长曲线(MTT法)和计数克降形成率检测缺氧对神经干细胞增殖的影响。缺氧培养后,再用含10%胎牛血清的培养基进行分化培养,用免疫荧光技术检测缺氧对神经干细胞分化、凋亡及形态变化的影响。结果显示:缺氧干预后神经干细胞的增殖率明显下降,细包凋亡数增加,分化的神经元和胶质细胞的突起变短变粗,数量减少,但神经元和胶质细胞的分化比例未见明显变化。结果提示:缺氧可严重影响神经干细胞的存活和正常分化、且影响程序与缺氧剂量有量效关系。

钙离子与缺氧性神经干细胞凋亡的相关性研究

目的检测钙离子浓度在缺氧性神经干细胞凋亡过程中的变化,以探讨缺氧性神经干细胞凋亡的发生机制。方法从大鼠胚胎神经管获取神经干细胞,经无血清悬浮培养技术获得神经球。对所获神经球行干细胞克隆试验、Br-dU掺入标记试验、nestin、NSE和GFAP免疫荧光染色,以确认神经干细胞的生物学特性。三气培养箱予以缺氧干预,按缺氧程度分为5%O2组、10%O2组和正常对照组(20%O2),每个实验组又依缺氧干预时间的不同,分为24h、48h、72h、96h、120h5个亚组。用激光扫描共聚焦显微镜和Fluo-3荧光探针标记技术检测神经干细胞内钙离子浓度;采用An-nexinⅤ-FITC/PI检测细胞凋亡率。结果5%O2120h组和10%O2120h组中神经干细胞凋亡率显著高于正常对照组和其他缺氧干预组,并且伴随有胞内钙超载。结论细胞内钙超载可能是缺氧性神经干细胞凋亡机制中的一个重要环节。

补阳还五汤载药血清对缺氧性神经干细胞增殖和分化的影响

目的:观察补阳还五汤载药血清对缺氧环境中神经干细胞的增殖及其分化的影响。方法:从孕14d(E14d)大鼠获得神经干细胞,经无血清培养基悬浮培养并传代。取传3代神经干细胞,添加不同浓度的载药血清,在5%O2三气培养箱中培养。MTT法检测不同缺氧时间点神经干细胞的增殖情况。兔抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)和兔抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色观察神经干细胞的分化情况并分别计数。结果:10%缺氧载药血清组神经干细胞MTT检测的OD值显著增高;各浓度组分化的NSE及GFAP阳性细胞的比例均升高,尤以10%缺氧载药血清组升高显著。结论:补阳还五汤药物血清对神经干细胞缺氧性损伤具有明显的保护作用,并可促进缺氧性神经干细胞的分化,10%浓度为最佳干预浓度。

葡萄糖对神经干细胞缺氧性损伤保护作用的实验研究

目的探讨葡萄糖对神经干细胞缺氧性损伤的保护作用。方法分离培养小鼠胚胎11.5d神经干细胞。将三气培养箱的氧气浓度调至5%,以制备缺氧环境。分别在缺氧前后于无血清培养基中加入不同剂量的葡萄糖,同时设常氧常糖正常对照。通过计数克隆形成率和MTT法检测干细胞的存活和增殖情况,AnnexinⅤ-FITC/PI染色、激光扫描共聚焦显微镜观察和计算其凋亡率。结果缺氧前加入30 mmol/L葡萄糖,神经干细胞的存活率和增殖率较常糖缺氧组明显增高,但仍低于常糖常氧正常对照组。缺氧后再加入葡萄糖时,其保护作用不明显。结论缺氧前给予足够浓度的葡萄糖对神经干细胞的缺氧性损伤具有一定的保护作用。

基于网络药理学和分子对接探讨抗腮腺炎糖浆治疗流行性腮腺炎的作用机制

目的基于网络药理学和分子对接探讨抗腮腺炎糖浆治疗流行性腮腺炎的作用机制。方法通过TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction等数据库,挖掘抗腮腺炎糖浆化学成分和潜在靶点;使用GeneCards、OMIM和Drugbank数据库获取流行性腮腺炎相关靶点;绘制韦恩图找到抗腮腺炎糖浆作用靶点与流行性腮腺炎相关靶点的交集;利用STRING数据库构建蛋白质相互作用网络,筛选核心作用靶点;采用Cytoscape软件绘制中药-成分-疾病靶点网络;使用Metascape平台寻找核心作用靶点富集的通路和功能;通过Auto Dock Vina等软件完成有效药物成分与核心靶点蛋白的分子对接验证。结果挖掘到抗腮腺炎糖浆化合物96个,药物作用靶点823个,选取疾病靶点732个,通过韦恩图找到交集靶点87个,筛选核心靶点36个,通过富集分析得到KEGG通路112条,GO生物过程892条,GO细胞组成22条,GO分子功能58条;分子对接结果显示核心靶点与有效成分之间具有较高的结合活性。结论抗腮腺炎糖浆可能通过调控IL-6、TNF、STAT3、HSP90AA1、IL-1B、TP53、IL10、TLR4、EGFR、CCL2等靶点,以及脂质与动脉粥样硬化相关通路、癌症相关通路、疟疾相关通路、IL-17信号通路、炎性肠病通路、Th17细胞分化、TNF信号通路等通路发挥治疗流行性腮腺炎作用,为诠释抗腮腺炎糖浆临床治疗流行性腮腺炎的机制提供了依据。

促红细胞生成素对神经干细胞缺氧性损伤保护作用的实验研究

目的观察外源性EPO对神经干细胞缺氧性损伤的保护作用,为缺氧缺血性脑损伤的治疗提供新思路。方法从孕11·5d(E11·5d)大鼠获得神经干细胞,经无血清培养基悬浮培养并传代,对所获细胞的自我增殖、自我更新及其多分化潜能进行检测。取传3代神经干细胞中添加不同剂量的EPO,在5%O2培养箱中培养120h。通过计数干细胞克隆形成率和MTT法检测神经干细胞的增殖情况。于含血清分化培养基中加入不同剂量的EPO,用NSE和GFAP免疫细胞化学染色观察神经干细胞的分化情况。采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色,激光扫描共聚焦显微镜观察、检测细胞凋亡率。结果加入EPO后神经干细胞的克隆形成率和MTT检测的OD值显著增高,细胞凋亡率显著下降,NSE阳性细胞的比例明显升高,其作用随剂量增加而增大,50U/ml时作用最大。结论EPO对神经干细胞缺氧性损伤具有明显的保护作用,并可促进神经干细胞向神经元方向分化。EPO的这种作用随剂量增加而增大,50U/ml时达高峰。

神经上皮干细胞的分离培养及其体外分化特性的观察

目的探讨大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞的分离培养条件,并观察其在体外的分化特性。方法采用显微解剖、机械吹打、无血清悬浮培养方法分离培养神经上皮干细胞,采用巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色技术检测神经上皮干细胞,用NSE和GFAP免疫组化染色检测并计数神经细胞和神经胶质细胞。结果大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞在无血清培养基中可形成大量呈nestin抗原阳性细胞构成的神经球,经传代有血清培养后分化为NSE阳性和GFAP阳性细胞,其中NSE阳性细胞占细胞总数的47.7%,GFAP阳性细胞占细胞总数的39.8%。结论胎鼠神经管神经上皮干细胞在无血清培养中可增殖和传代,在有血清培养中可分化为神经细胞和神经胶质细胞,两者之比为47.7∶39.8。

补阳还五汤对神经干细胞缺氧性损伤保护作用的实验研究

目的:观察补阳还五汤载药血清对神经干细胞缺氧性损伤的保护作用。方法:从孕11.5d(E11.5d)大鼠获得神经干细胞,经无血清培养基悬浮培养并传代,对所获细胞的自我增殖、自我更新及其多分化潜能进行检测。取传3代神经干细胞,添加不同浓度的药物血清,在5%O2三气培养箱中培养120h。通过MTT法检测神经干细胞的增殖情况。用兔抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)和兔抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色观察神经干细胞的分化情况。结果:药物血清组神经干细胞MTT检测的OD值显著增高,NSE和GFAP阳性细胞的比例明显升高。结论:补阳还五汤药物血清对神经干细胞缺氧性损伤具有明显的保护作用,并可促进缺氧性神经干细胞的分化。

中西医临床专业形态实验改革对学生动手能力的影响

人体解剖学、组织学与胚胎学及病理学,属于基础医学课程中的形态学学习范畴,近年来,由于基础课学时缩短,加大了这些基础课程的学习难度,众所周知,实践教学是医学院校整体教学工作重要的组成部分。随着教学改革的不断深入,笔者大胆实践,开展了以提高动手能力和实践创新能力为导向的实验课教学改革,将形态学课程中的实验教学部分进行整合,在原有课时不变的基础上,增加综合实验内容,充分提高学生的动手能力,并跟踪开展调查和反馈及效果评价，在提高实验教学质量及培养高素质医学生的创新能力方面打下了坚实基础。

基于组胚实验绘图成绩与期末成绩关系探讨实验形成性评价的考核方法

形成性评价的关注重点是学习过程,科学合理的考核方法是实现形成性评价的关键环节^([1])。近年来,中医院校组织学与胚胎学教学现状较前有较大变化,单一传统的实验绘图成绩考核远不能客观反映学生的学习过程。笔者就天津中医药大学不同入学年份、不同学制及不同专业学生的实验绘图成绩和期末成绩进行相关性统计分析,找出现行实验形成性评价存在的问题,提出可行改进方法。

缺氧性神经干细胞钙离子浓度变化和葡萄糖保护作用的研究

为了从钙离子角度探讨葡萄糖对神经干细胞缺氧性损伤保护作用机制,本实验将三气培养箱的氧气浓度调至5%制备缺氧环境。分别在缺氧前后于无血清培养基中加入不同剂量的葡萄糖,同时设常氧常糖正常对照。通过MTT法检测干细胞的存活和增殖情况,用激光扫描共聚焦显微镜和Fluo-3荧光探针标记技术检测神经干细胞内钙离子浓度。结果显示,缺氧前加入30mmol/L葡萄糖,神经干细胞的存活率和增殖率较常糖缺氧组明显增高,其胞内钙离子浓度显著低于常糖缺氧组。缺氧后再加入葡萄糖时,其保护作用不明显。本实验提示:缺氧前给予足够浓度的葡萄糖可通过抑制胞内钙超载机制对神经干细胞损伤起到一定的保护作用。

当归补血汤载药血清对骨髓基质细胞增殖及细胞因子表达的影响

目的:观察当归补血汤载药血清对小鼠骨髓基质细胞增殖及细胞因子分泌的影响。方法:分离骨髓基质细胞,接种于96孔板培养,在相差显微镜下观察细胞形态和生长状况;将细胞分4组,用含有不同剂量的当归补血汤载药血清作用,采用MTT法检测各组细胞的增殖活性及ELISA法检测造血生长因子GM-CSF和IL-3的表达情况。结果:在不同浓度的载药血清作用下,骨髓基质细胞增殖和分泌GM-CSF和IL-3显著(P<0.05),呈剂量依赖性,但浓度过高可减弱细胞的增殖分泌效应。结论:当归补血汤载药血清能够促进骨髓基质细胞的增殖以及GM-CSF和IL-3的分泌。

当归补血汤对骨髓辐射损伤过程中NF-κB及bax、bcl-2表达的影响

目的观察当归补血汤对骨髓辐射损伤过程中核因子(NF)-κB及下游因子bax、bcl-2表达的影响。方法取原代培养7 d的骨髓基质细胞用137Cs-γ射线(4 Gy)照射,在照射后24 h用含不同剂量的当归补血汤载药血清干预24 h;小鼠同剂量γ射线照射后,灌胃给药同剂量的当归补血汤1 w,处死小鼠取骨髓。应用免疫荧光技术,real-time RT-PCR分别检测辐射损伤骨髓基质细胞模型和小鼠模型骨髓的NF-κB及下游因子bax、bcl-2的表达。结果辐射可激活NF-κB信号,启动MSC和骨髓细胞凋亡过程。经当归补血汤干预,MSC和骨髓细胞内可下调NF-κB基因的表达,但随着药物剂量加大下调趋势减缓(P<0.05);当MSC和骨髓细胞内bcl-2/bax比值升高时,对促凋亡信号敏感性减弱,表现出抗凋亡的特点,细胞存活寿命延长(P<0.05)。结论当归补血汤可通过影响NF-κB的表达调节bcl-2/bax,减少骨髓内细胞凋亡,有利于辐射损伤后机体造血免疫机能的恢复。

中药废渣在食用菌培养中的生物转化再利用研究

目的:探讨中药废渣的再利用价值及生物转化的可行性。方法:采用不同浓度的中药废渣培养基对平菇进行栽培试验,观察平菇菌落的生长情况。结果:平菇菌丝体可以在中药废渣培养基上生长,其生物转化率在50%浓度的废渣培养基中较高。结论:中药废渣的生物转化是可行的,并在食用菌栽培生产上有极大的利用价值。

新生小鼠精原细胞分离和纯化的实验研究

目的:分离和纯化7～8d新生雄性小鼠精原细胞,为深入研究生精机理及其影响因素提供细胞来源和技术支持。方法:采用组合酶消化法制备7～8d雄性小鼠的生精细胞悬液;Percoll密度梯度离心法分离精原细胞,贴壁培养法进一步纯化精原细胞;滴片进行碱性磷酸酶染色;取同时间段雄性小鼠睾丸组织冰冻切片进行碱性磷酸酶染色。结果:精原细胞主要分布于45%～55%梯度间的Percoll中,经贴壁培养后纯度达75.2%。结论:用上述方法成功地分离和纯化了小鼠精原细胞。

补阳还五汤对奥沙利铂致神经病理痛模型大鼠的干预作用

[目的]研究通过建立奥沙利铂致大鼠慢性神经病理痛模型,选择补阳还五汤为代表方揭示其对奥沙利铂致神经病理痛的干预作用。[方法]选取健康清洁级雄性成年大鼠60只,随机分为4组。空白对照组、奥沙利铂组、补阳还五汤对照组和补阳还五汤治疗组。检测4组大鼠热痛阈值并监测大鼠体质量变化。[结果]第2周补阳还五汤治疗组热痛阈值与模型组相比差异有统计学意义。补阳还五汤可拮抗奥沙利铂化疗大鼠引起的热痛阈值和体质量的变化。[结论]补阳还五汤治疗奥沙利铂所致神经病理痛符合中医学的基本理论,该方具有广阔的应用前景。

当归补血汤干预移植肌卫星细胞受体小鼠造血功能重建的研究

目的观察当归补血汤对移植骨骼肌卫星细胞(muscle satellite cell,MSC)受体小鼠造血功能重建的影响。方法分离雄性同系小鼠的MSC并培养鉴定。经8Gy137Cs-γ射线照射的雌性昆明种受体鼠随机分为6组:空白对照组、移植MSC组、当归补血汤不同剂量(1、3、5、10倍临床等效剂量灌胃7天)干预的移植雄性MSC4组。观察移植后1、2、3周受体鼠脾集落形成单位(colony forming unit spleen,CFU-S)数、外周血白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)的变化,3周存活率等指标,并采用PCR方法鉴定其造血重建的来源。结果培养的MSC呈desmin染色阳性;第2周时移植MSC各组WBC明显升高(P<0.05),给药2、3、4组Hb明显回升(P<0.05);第3周时与移植MSC组比较,给药3、4组WBC及Hb升高明显(P<0.05),给药4组PLT恢复显著(P<0.05)。第2周时与空白对照组比较,给药3、4组CFU-S明显增多(P<0.05),对移植的存活小鼠进行Y染色体PCR分析,证实重建雌性受体鼠造血功能的细胞来自雄性供体。结论当归补血汤干预有助于移植MSC的受体鼠造血功能重建。

受致死剂量照射模型小鼠输注骨骼肌卫星细胞后造血功能的变化(英文)

背景:骨骼肌卫星细胞是一种具有增殖、分化潜能的肌源性干细胞。近年,国外已有报道骨骼肌细胞具可被某种特定微环境因子激活分化为造血干细胞,从而具有造血重建的潜能。目的:初步验证肌源性的成体干细胞-骨骼肌卫星细胞分化为造血干细胞的能力。设计:验证性动物实验。单位:天津中医药大学基础医学院组胚教研室。材料:选用雌性昆明种成年小鼠65只,体质量25～28g。出生5d昆明种乳鼠5只,均由北京大学医学部实验动物中心提供。方法:实验于2001-08/2003-08在北京大学医学部人体解剖学与组织胚胎学系细胞培养室完成。胶原酶、胰蛋白酶消化分离5只乳鼠骨骼肌卫星细胞,分离5只成年昆明种小鼠骨髓单个核细胞。取成年雌性小鼠60只作为受体,用60Coγ8.0Gy照射,然后随机分为4组:对照组不做任何处理;培养液输注组小鼠尾静脉注射DMEM/F-12培养液;卫星细胞输注组小鼠尾静脉注射卫星细胞悬液0.3mL(细胞浓度1×109L-1);骨髓细胞输注组小鼠尾静脉注射骨髓细胞悬液0.3mL(细胞浓度1×109L-1)。主要观察指标:①观察各组小鼠14d存活率。②照射后14d处死存活下来的受体小鼠:肉眼计数脾脏表面结节数;对骨髓单个核细胞涂片进行Wright-Gimesa染色。结果:①脾集落形成单位的测定:照射后14d,卫星细胞注射组小鼠脾结节数与骨髓细胞注射组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。②骨髓单个核细胞组织学鉴定结果:卫星细胞输注组与骨髓细胞输注组骨髓单个核细胞涂片中有相对较多的早期造血细胞出现,其形态符合早期造血细胞的生物学特性。③被照射鼠的存活情况:对照组和培养液输注组小鼠在被照射后9～13d全部死亡。照射后14d,卫星细胞输注组和骨髓细胞输注组分别有8和13只鼠存活。结论:骨骼肌卫星细胞具有诱导分化为造血干细胞的功能。

形上与形下相结合,服务于人类健康——吴以岭院士解读“中西医整合医学”

中西医整合医学是一种全新的尝试,中国工程院吴以岭院士从中医和西医各自的哲学和文化背景及学科特点、解放后中西医结合取得的重大成就及新时期中西医整合难得的历史机遇,充分肯定了中西医整合的历史必然性;强调了树立大科学观、加强中医科学属性研究,是实现中西医整合的先决条件;结合自己的学术研究和临床感悟,建议以人才培养、临床疗效及科学研究为关键突破口,推动中西医整合事业的发展。最后,吴院士提出:中西医整合应当是形而上和形而下有机结合的研究,是解决人类疾病和健康问题的可期待新医学。