肺炎支原体P1黏附蛋白基因的克隆与表达

目的对肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,Mp)3’端的P1黏附蛋白基因片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和表达产物的免疫性分析,为临床诊断试剂和疫苗的研制打下基础。方法应用PCR技术直接从MpFH株染色体DNA中扩增894bp的3’端p1基因片段(p1’),将此基因片段插入表达载体pGEX-6P-1后,转入大肠杆菌BL21扩增后提取重组质粒进行酶切、PCR扩增及核苷酸测序进行鉴定。诱导阳性克隆株表达重组蛋白后纯化,用兔抗Mp多克隆血清通过免疫印迹实验鉴定其免疫反应性。结果插入重组质粒的p1基因片段经测序后,与GenBank中p1基因核苷酸序列(AF290001、AF290002、AF286371、AE000002、M21519、M18639)比较,其同源性为99.66%～100%。氨基酸序列同源性为99.32%～100%。经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量约为59kDa。免疫印迹实验证实重组蛋白是P1黏附蛋白抗原。结论成功构建了pGEX-6P-1-p1’重组质粒并获得表达。此p1’基因重组质粒表达的蛋白具有免疫反应性,有希望成为特异性抗原诊断试剂和疫苗的候选抗原。

肺炎支原体感染鼠T淋巴细胞活化的动态变化

动态观察肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)感染鼠T淋巴细胞的数量及其亚群的变化,为正确评价T淋巴细胞在Mp感染中的作用提供理论依据。Mp滴鼻感染小鼠,在感染后不同时间点采集标本,流式细胞术检测感染鼠外周血中T淋巴细胞数量变化,ELISA测定脾细胞上清中TGF-β1、IL-10含量。结果表明,Mp感染不同时间点外周血中CD4+T淋巴细胞数量变化不明显或呈下降趋势。CD4+/CD8+比值下降。初次感染和再次感染的第3天、第7天,TGF-β1、IL-10表达水平升高。肺炎支原体感染对CD4+T淋巴细胞有一定抑制作用,外周血TGF-β1、IL-10的表达与脾细胞中CD4+T淋巴细胞数量变化成反比。提示TGF-β1可能参与了对Th1细胞的负调控作用。

肺炎支原体感染鼠P1特异抗原的动态检测

通过实验动物模型探讨肺炎支原体感染动物肺泡灌洗液中特异抗原检出率的动态变化,为肺炎支原体感染的临床诊断提供理论依据。小鼠经鼻自然感染肺炎支原体,分别采集感染后不同时间点小鼠的支气管灌洗液,应用量子点标记肺炎支原体P1蛋白抗体,直接免疫荧光法检测感染鼠肺泡灌洗液中肺炎支原体P1特异抗原,同时通过PCR检测肺组织肺炎支原体DNA及肺组织病理切片观察肺部炎性变化确定小鼠感染。结果显示,感染鼠肺炎支原体特异抗原在感染后第3天检出阳性率为75%,第7天达高峰为83%,之后随病程延长,抗原检测的阳性率逐渐下降,在感染后第14、21天检出阳性率分别为58%和25%。肺炎支原体特异抗原在感染早期检出率高。应用量子点标记肺炎支原体P1蛋白抗体,直接免疫荧光法检测肺炎支原体特异抗原可应用于肺炎支原体感染的早期诊断。

肺炎支原体粘附因子及粘附相关蛋白的研究进展

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)主要引起人非典型肺炎及支气管炎.其侵入呼吸道后,借助粘附细胞器(attachment orgabekke)牢固地粘附于上皮细胞表面的受体上,使得肺炎支原体能够在呼吸道上皮细胞定植,并由此感染宿主.

肺炎支原体感染实验室检测的研究进展

感染性肺炎（infectious pneumonia）指人体受病原微生物感染而发生的肺炎，病原体主要包括细菌、肺炎支原体、真菌和病毒等。每年有数以万计的人患病，且无季节特征，一年四季均可发生，病情严重程度无明显特征，各年龄段人群均可感染，尤其以老年人和儿童患者易感，重症者甚至可导致死亡［1-2］。社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia， CAP）患者中3．3％-40％是由肺炎支原体感染引起，其中大约25％的肺炎支原体感染者合并肺外并发症，引起其他器官的损伤。肺炎支原体感染者临床症状多样，肺部体征一般较轻，有时甚至无任何肺部症状，仅以肺外并发症为首要症状。根据患者的流行病史、临床症状、胸片等相关检查，难以将其与一般病毒或其他细菌感染引起的呼吸道疾病相鉴别，所以在肺炎支原体感染的诊断中病原学检查具有重要作用。目前，越来越多的报道提示肺炎支原体感染与支气管炎急性发作、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、急性感染性多发性神经炎（格林－巴利综合征）、中风、冠心病、多发关节炎，以及人类免疫缺陷病毒（HIV）阳性者感染肺炎支原体导致血清阳性率升高有一定的关联［3］，因此，呼吸道感染性疾病和非呼吸道感染性疾病均可能是由于肺炎支原体感染引起。临床治疗过程中需要针对不同的病原体而合理使用抗菌药物，因此，早期检测出肺炎支原体对指导治疗非常重要。在头孢类不过敏的人群中，头孢类药物用药安全指数较高，价格较便宜，抗菌效果较好，临床使用经验较多，患者接受性较强，所以临床医生通常首先选择头孢类药物治疗非病毒性感染疾病。因肺炎支原体无细胞壁，所以头孢类药物对肺炎支原体通常无效，鉴于上述原因支原体感染治疗面临的最大问题就是如何尽快选择合理有效的抗菌药物。目前，临床上部分医生一般先给予患者头孢类抗生素，治疗一段时间无效后再换用大环内酯类抗生素；部分基层医院儿科医生在尚未诊断为肺炎支原体感染，即开始给予大环内酯类抗生素治疗，上述做法均不是治疗感染的有效措施，也不能预防抗菌药物耐药。因此，早期、准确检测肺炎支原体，可及时指导临床治疗，进而预防可能发生的流行和并发症，减少抗菌药物的滥用，减轻患者的病痛与负担。

肺炎支原体感染小鼠Th1/Th2平衡状况及Tim-3 mRNA的表达

目的通过检测Tim-3mRNA的表达水平及IFN-γ、IL-4的含量,初步探讨肺炎支原体感染鼠Th1/Th2细胞的动态变化及Tim-3的免疫调控作用。方法通过滴鼻感染建立肺炎支原体肺炎小鼠模型,观察小鼠的一般状况,分别于感染后3d、5d、7d、14d、21d取材,应用RT-PCR方法检测肺组织和脾脏Tim-3mRNA的表达;采用ELISA法检测肺泡灌洗液中细胞因子IFN-γ、IL-4的含量。结果实验组IFN-γ于3d出现升高(t=2.309,P<0.05),5dIFN-γ开始下降,而IL-4于3d开始升高并一直持续到7d(t=6.436,P<0.05),之后逐渐恢复正常,肺组织和脾脏Tim-3mRNA的表达均于5d达到峰值(t=4.727,P<0.05;t=7.962,P<0.05),且肺组织和脾脏Tim-3mRNA表达量与IL-4呈正相关(r=0.561,P<0.05;r=0.462,P<0.05),从5d开始与IFN-γ呈负相关(r=-0.379,P<0.05;r=-0.431,P<0.05)。结论小鼠感染肺炎支原体后Th1/Th2失衡,以Th2介导的免疫反应为主;Tim-3可能参与了感染后对Th1细胞的负调控。

量子点标记肺炎支原体重组蛋白抗体检测抗原方法的建立

目的建立一种用CdSe/ZnS量子点标记技术用于肺炎支原体检测的方法。方法用重组Mp P1蛋白免疫动物制备免疫血清,硫酸铵沉淀法及离子层析法纯化IgG抗体,纯化抗体用CdSe/ZnS量子点标记,离心沉淀法纯化标记产物。用标记抗体检测Mp抗原。结果量子点标记抗体直接玻片荧光法检测Mp抗原具有较高的敏感性(检测灵敏度在0.001μg/mL),且与呼吸道常见病原菌无交叉反应。结论成功建立量子点标记技术检测肺炎支原体抗原方法,具有操作简单、检测快速的优良,适用于Mp感染的早期诊断。

肺炎支原体CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的表达及鉴定

目的探讨肺炎支原体CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的免疫反应活性。方法对CARDS毒素蛋白的抗原表位进行分析,选取10个重要的表位进行拼接,反向翻译后合成并克隆,插入pET28a表达载体构建pET-CARDS表达质粒并转入受体菌。经IPTG诱导表达的多表位拼接CARDS蛋白使用6×His单克隆抗体和人阳性血清进行了免疫印迹的检测。结果 CARDS毒素蛋白的多表位拼接抗原表达载体构建成功,诱导后表达大小为30KDa的重组蛋白,Western blot测定其能与6×His单克隆抗体和人阳性血清发生反应。结论本研究选取的CARDS毒素蛋白抗原表位具有较强的免疫活性,可为Mp感染的诊断提供新的候选抗原。

肺炎支原体重组蛋白抗原的初步鉴定

克隆并表达肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1黏附蛋白D-2区基因片段,进而对重组蛋白的抗原特异性进行鉴定.应用PCR技术获取目的基因片段,并构建含有目的基因片段的重组质粒,用重组质粒酶切图谱法、PCR扩增及核苷酸测序方法鉴定重组质粒.而后将其转入大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE分析重组蛋白的相对分子量,免疫印迹实验鉴定其免疫反应性,并用ELISA实验测定重组蛋白抗原的特异性.结果重组质粒中的p1基因片段经测序后,与GenBank中p1基因核苷酸序列比较,其同源性为99.66%～100%;经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量约为 59 ku;免疫印迹实验和ELISA实验证实,Mp免疫血清和Mp感染患者血清都能与重组蛋白发生特异反应.研究中的含P1黏附因子D-2区基因的重组质粒已成功构建,其表达的重组蛋白具有特异的免疫反应性,初步ELISA实验证实,本研究获得的重组蛋白可用于临床标本检测.

肺炎支原体重组蛋白抗原与膜蛋白抗原诊断试剂在临床应用中的比较

目的以肺炎支原体(Mp)重组蛋白做包被抗原检测临床呼吸道感染患儿血清标本,验证重组蛋白抗原的诊断价值。方法利用Mp重组蛋白抗原包被酶标板,ELISA法检测临床疑似Mp感染患儿的血清标本,同时用Mp膜抗原被动凝集试验平行检测,并对比分析两种方法的检测结果。结果重组蛋白抗原ELISA检测Mp抗体的阳性率为49.00%(98/200),膜抗原被动凝集试验Mp抗体的阳性率为63.50%(127/200)。两种检测方法的总符合率为70.50%。阳性符合率为58.45%。结论Mp重组蛋白抗原ELISA检测肺炎支原体感染有诊断价值,其特异性优于膜抗原被动凝集试验。

肺炎支原体重组P1蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)重组P1蛋白多克隆抗体,为Mp抗原诊断试剂的制备奠定基础。方法用Mp重组P1蛋白免疫家兔,ELISA法测定免疫血清抗体效价;硫酸铵沉淀及离子交换层析法纯化抗体;紫外分光光度法测定抗体的浓度;SDS-PAGE分析抗体的纯度;量子点标记纯化抗体,分析抗体的免疫活性;直接免疫荧光法检测抗体的特异性。结果重组P1蛋白兔免疫血清抗体效价为1∶25 600;纯化的抗体浓度为3.689μg/μl;SDS-PAGE显示相对分子质量58 000的重链条带;用量子点标记纯化的抗体仍保持较高的免疫活性,与其他呼吸道常见病原菌均未发生特异性结合。结论获得的纯化Mp P1蛋白IgG抗体具有较高的免疫活性和特异性,可用于临床Mp感染的抗原诊断。

肺炎支原体双蛋白多抗原表位表达载体的构建

目的构建肺炎支原体(Mp)双蛋白多特异抗原表位表达载体,提高重组蛋白抗原的敏感性。方法应用生物信息学方法筛选Mp P116粘附蛋白抗原表位序列,PCR点突变技术获取P116蛋白基因片段,与pMD-T载体重组,转入大肠埃希菌JM109,通过限制性酶切图谱和基因序列分析鉴定重组质粒。酶切回收P116基因片段与pGEX 6P-1-P1 DNA重组,转入大肠埃希菌JM109菌株。用Glutathione Sepharose 4B纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析表达产物的相对分子量,用Mp免疫血清进行免疫印迹试验,鉴定重组蛋白的免疫原性。结果 PCR点突变扩增Mp黏附蛋白P116的基因片段为597 bp,该基因片段与已知的基因库序列分析比较,除两个突变位点由UAG突变为UGG外,其余核苷酸序列同源性为100%。SDS-PAGE分析多表位重组蛋白相对分子质量(Mr)为77.8 kDa。免疫印迹结果显示,Mp兔多价血清能与纯化的78KDa的重组蛋白发生免疫反应。结论本研究成功构建了Mp双蛋白多表位的表达载体。该表达载体表达的重组蛋白具有Mp特异的免疫反应性。重组蛋白的敏感性有待进一步鉴定。