基于全基因组测序的院内耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药性及同源性分析

目的:基于基因组学研究医院内碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因分布,毒力情况及同源性分析,深入阐明院内感染的分子机制,为多重耐药菌株临床治疗和预防提供实验室依据。方法:收集1株临床分离的碳青霉烯耐药的泛耐药肺炎克雷伯菌,经培养鉴定,测定对常用抗生素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),多位点序列分型(multi⁃locus sequence typing,MLST)进行基因分型并行全基因组测序。根据基因测序结果,选择相关耐药基因在临床收集的另外50株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌中进行扩增检测,验证其携带情况,对测序结果进行进一步的阐述。结果:药敏结果显示该菌对除粘菌素和替加环素外的抗生素全部耐药,测序结果显示该菌染色体基因序列全长5468925 bp,含有4个质粒(179972 bp、141377 bp、85181 bp和20247 bp),共有5984个蛋白质编码基因,85个tRNA基因和25个rRNA操纵子。此外,该菌携带有大量参与编码多种抗生素的耐药基因。MLST结果显示,该菌基因型为ST11型,该菌大部分序列与之前在四川和杭州报道的菌株类似,最接近的是一株编号SCKP020029(NCBI Accession number:CP029384)的肺炎克雷伯菌。收集的另外50株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌确认均为产超广谱β内酰胺酶(extented⁃spectrum beta⁃bactamases,ESBLs),其中97%为ST11型。脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)结果显示分属3个克隆。在这些菌株中,耐药基因检出率分别为KPC⁃2(98%),SHV⁃11(98%),TEM⁃1(76%),CTX⁃M(76%),Oqxb1(66%),qnrS(70%),Int1(42%),sul1(82%),sul2(96%),iutA(88%),iucABCD(10%)和rmpA2(100%)。结论:实验结果揭示了院内碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的基因组学具有高度相似性,流行病学具有聚集性和散发性交叉的特点。抗生素耐药结果提示了细菌耐药中选择性抗生素耐药压力的作用效应,同时质粒耐药基因在细菌中的传播提示这些耐药菌在院内的传播以质粒传播为主,有效的院内感染监测、隔离和控制这类质粒的传播是减少这种细菌耐药感染必不可少的措施。

黄芪皂苷对不同类型乳腺癌细胞的作用效应及机制研究

目的:研究中药黄芪皂苷对不同类型乳腺癌细胞的作用效应及对胞内miRNA-155表达的影响,探讨其发挥效应可能的途径,为阐明中药的抗肿瘤作用机制和其临床应用的推广提供理论依据。方法:选择代表不同类型的乳腺癌细胞系MCF-7,MDA-MB-231和T-47D,选取对数生长期的细胞随机分为对照组和加药组,在加药组中加入不同浓度的黄芪皂苷溶液(终浓度0μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL),绘制细胞生长曲线并检测细胞克隆形成情况,并用流式细胞仪检测细胞凋亡,使用qRT-PCR测定FOX3a、SOCS1的mRNA表达水平。结果:黄芪皂苷在体外能抑制3种乳腺癌细胞系的生长和增殖,并且诱导乳腺癌细胞凋亡,但作用效应不尽相同。对T-47D的作用最强并且呈剂量依赖型,对MDA-MB-231和MCF-7的作用稍弱并呈时间-剂量依赖型。黄芪皂苷能使MCF-7和T-47D中的FOX3a、SOCS1表达降低,而MDA-MB-231中FOX3a,SOCS1升高。结论:黄芪皂苷对乳腺癌有抑制增殖、诱导凋亡的作用,并且对不同的细胞类型作用效应不同。在MCF-7和T-47D中,黄芪皂苷通过活化JAK-STAT-SOCS和INS/IGF-1信号通路中的分子FOX3a,SOCS1来发挥效应,而在MDA-MB-231中则不然,其作用的准确途径和机制尚需进一步地深入研究。

非综合征耳聋大家系永生细胞系的建立及几种EB病毒转化外周血淋巴细胞建系方法的探讨

永久保存珍贵的家系材料,是对该家系进行深入研究的基础,为此采用EB病毒(Epstein Barrvirus,EBV)转化淋巴细胞的方法对中国江苏淮阴地区非综合征耳聋大家系行建系工作。该家系患者呈典型的母系遗传特征,且研究发现患者中均具有线粒体DNA12SRNAA1555G突变,是迄今世界上最大的非综合征耳聋家系之一,在该家系的建系过程中使用了4种不同的方法。建系结果分别为:微量全血法1株,冻存全血法1株,冻存白细胞法14株及环孢霉素A(CyA)法36株,共计52株。文章就建系工作及这4种转化方法作一简单探讨。

1320例血培养结果分析

目的了解血培养阳性主要科室的分布情况及致病菌种类分布和耐药情况,为临床合理选择抗生素、有效治疗感染患者提供科学依据。方法利用BD9120全自动血培养仪和VITEK细菌鉴定仪进行血培养及细菌鉴定分析,用K-B法进行药敏试验。结果 1320例血培养标本中,检出细菌136例,检出率为10.3%,其中血液科、肝炎感染科和重症监护病房(ICU)阳性检出率位列前3名,分别为56例(41.2%)、10例(7.4%)、9例(6.6%)。大肠埃希菌、绿脓杆菌和凝固酶阴性葡萄球菌的检出率位居前3名,占菌株总检出率的70.8%。药敏结果显示绝大部分检出的细菌均有耐药情况出现。结论临床应重视患者的早期血培养检验且根据药敏试验结果,合理使用抗生素。

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌金属酶的筛选及分型研究

目的了解我院耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌的金属酶(MBL)携带情况及型别特点,并探讨进行金属酶筛选的简便方法。方法采用K-B法进行药物敏感性试验,采用2-巯基乙醇纸片与EDTA纸片协同试验筛选产MBL菌株,并对MBL基因进行PCR和序列分析。结果45株碳青霉烯类抗生素耐药菌株用2-巯基乙醇纸片协同试验阳性3株,EDTA纸片协同试验阳性4株,经PCR验证均为阳性,除此之外,还有1株PCR阳性而2种纸片协同法都没有筛选出来。其中2-巯基乙醇纸片协同试验筛选的灵敏度为60%,特异度为95%,准确率为95%,EDTA纸片协同试验的灵敏度为80%,特异度为97%,准确率为97%。引物IMP扩增阳性4株,VIM扩增阳性1株,PCR产物纯化测序后发现IMP均为IMP-1型而VIM为VIM-2型。结论用EDTA协同试验法对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌进行MBL的筛选简单有效,可用来在临床微生物实验室作为产MBL铜绿假单胞菌的初筛试验。分型研究表明我院流行的铜绿假单胞菌以产IMP-1型为主。

核基因参与人类线粒体12S rRNA突变相关非综合征耳聋的临床表型

人类线粒体DNA 12S rRNA A1555G突变可引起母系遗传性非综合征耳聋,并提高氨基糖甙类药物对该类耳聋的诱导作用。我们在江苏淮阴发现了一个非综合征耳聋大家系,家系个体发病呈典型的母系遗传特征,临床可表现为先天性耳聋、中年进行性耳聋乃至完全正常的表型。对家系个体进行研究后发现A1555G突变是引起该家系耳聋的主要原因。我们用EB病毒转化的方法对该家系部分个体行建系工作后,对家系中17个个体的类淋巴母细胞进行分析,其中包括具有耳聋症状的个体7人(患者组),具有同质性A1555G突变但表型正常的个体6人(携带组),正常婚配对照 5人,与正常婚配对照相比,患者组与携带组在线粒体蛋白合成速率及在葡萄糖或半乳糖培养基中的生长速度出现了不同程度的下降,且突变细胞系中线粒体功能缺陷的严重程度与个体的临床表型相关．这些发现强有力地支持了核基因参与了该疾病临床表型的形成。

慢性阻塞性肺病的病原学及细菌耐药性分析

目的探讨慢性阻塞性肺病(COPD)患者感染的病原菌情况与院内的耐药性比较分析。方法采用VITEK全自动微生物鉴定系统鉴定病原菌,按美国临床实验室标准化委员会的纸片扩散法进行耐药性、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)检测,统计分析采用WHONET5.4软件进行。结果培养阳性患者中革兰阴性菌感染占73.7%(肺炎克雷伯菌、绿脓假单胞菌及大肠埃希菌占前3位),革兰阳性菌感染占26.3%,且革兰阴性菌耐药率明显高于全院患者;ESBLs、MRS检出率分别为78.5%、76.1%,Fisher确切概率计算法革兰阴性菌的耐药率明显高于全院平均水平。结论COPD患者中革兰阴性菌占优势,且革兰阴性菌耐药率明显高于全院患者,ESBLs、MRS检出率高,提示感染患者细菌的高耐药性。

血清miR-155水平检测在乳腺肿瘤患者早期诊断中的研究

目的探讨血清miR-155检测在乳腺肿瘤早期诊断中的作用。方法提取20例早、中期乳腺肿瘤患者以及10例健康人血清中的总RNA,利用荧光定量技术系统分析与乳腺肿瘤极其相关的miR-155在血清中的表达情况。结果 miR-155在乳腺肿瘤患者血清中的表达与健康人相比均呈现出显著的高表达,两者表达水平经Mann-Whitney检验,P<0.05,说明miR-155的表达水平在乳腺肿瘤患者与健康人之间存在明显差异。结论疾病特异性miRNA或可作为肿瘤早期检测的血清学分子标志物。

1940例慢性阻塞性肺病患者感染的病原菌特点及其耐药性分析

目的分析慢性阻塞性肺病(COPD)患者感染的病原菌组成情况及其耐药性与院内耐药性比较。方法采用VITEK全自动微生物鉴定系统鉴定病原菌,按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的纸片扩散法进行耐药性、超广谱β内酰胺酶(ESBLs)及耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)检测,统计分析采用Whonet5.4软件进行。结果培养出的革兰阴性菌中肺炎克雷伯、铜绿假单胞菌及大肠埃希菌占前3位,革兰阳性菌中以葡萄球菌和肠球菌为主,ESBL、MRS检出率分别为78.5%与76.1%,Fisher确切概率计算法所得革兰阴性菌的耐药率明显高于全院患者所感染革兰阴性菌的平均水平。结论COPD患者感染以革兰阴性菌较为多见,且耐药率明显高于全院水平,ESBL、MRS检出率高,提示感染患者细菌的高耐药性。

黄芪皂苷干预乳腺癌细胞MCF-7的体外实验研究

目的:研究黄芪皂苷在体外对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞的增殖与凋亡的影响,探讨其抗肿瘤机制。方法:取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7,分为对照组和不同浓度黄芪皂苷组(2.5μg/m L,5μg/m L,10μg/m L,20μg/m L);采用CCK-8法检测黄芪皂苷对MCF-7细胞增殖抑制率的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Realtime PCR法检测Bcl-2、BAX、MMP-9、nm23-H1 m RNA的表达情况。结果:黄芪皂苷能抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖,抑制作用呈剂量-效应和时间-效应关系;黄芪皂苷能够诱导MCF-7的凋亡,早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均随着黄芪皂苷作用浓度的增加及作用时间的延长而增加;黄芪皂苷能上调BAX和nm23-H1基因的表达,同时使Bcl-2和MMP-9基因的表达下调。结论:黄芪皂苷在体外对乳腺癌细胞MCF-7的增殖和转移有抑制作用,其作用途径是通过调节细胞凋亡相关基因与肿瘤转移相关基因的表达,从而诱导肿瘤细胞的凋亡。

重症监护病房细菌培养菌株分布及耐药性分析

目的分析本院重症监护病房(ICU)致病菌分布特点,并对其药敏进行分析,为临床合理用药提供指导。方法回顾性分析ICU 2008年1月至2010年12月送检临床标本中分离出来的菌株情况,采用K-B法进行药物敏感性试验。结果铜绿假单胞菌仍然是ICU感染率最高的细菌,而鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌上升速度非常快,同时各个细菌对常用的抗菌剂敏感性均逐年降低。结论多重耐药菌和泛耐药菌在ICU的分离率逐年增高,迫切需要规范临床合理用药。

泛耐药鲍曼不动杆菌耐药基因的检测及其同源性分析

目的 对院内感染所分离出来的泛耐药鲍曼不动杆菌进行耐药基因检测并分析其同源性.方法 采用MIC法对2013年1月-8月分离自住院病人的鲍曼不动杆菌进行药敏筛选,取其中的34株采用PCR技术检测金属β内酰胺酶IMP,VIM基因,超广谱β内酰胺酶TEM,SHV与GES基因,苯唑西林水解酶（OXA） OXA-51,OXA-23,OXA-24与OXA58基因在实验菌株中的携带情况;利用脉冲场电泳（PFGE）对临床分离株进行基因分型及同源性分析.结果 该院上半年临床所分离的泛耐药鲍曼不动杆菌主要来自于ICU、急诊病房、呼吸科和神经外科,分别占总分离率的29.40％,17.64％,14.70％与11.76％;所有耐药菌株均同时携带多种耐药基因,OXA-51,OXA-23,VIM及TEM基因在菌株中的携带率均为100％,部分携带GES基因,携带率为29.4％,少量携带OXA 58和SHV基因,未检出OXA-24和IMP基因.PFGE结果显示院内共有4个不同类型的克隆株流行,其中A类最为多见且各科室间存在交叉感染.结论 泛耐药鲍曼不动杆菌的耐药机制是多基因协同作用的结果,在院内主要以克隆形式播散传播,局部流行呈现出型别特异性,除规范临床抗生素使用以减少泛耐药鲍曼不动杆菌的产生外,切断传播途径,防止交叉感染是非常必要的.

血液科病房2009～2012年血培养菌株分布特点及其耐药性分析

目的对该院血液科病房血培养阳性标本中的致病菌分布特点进行统计,并对其耐药性变迁进行分析,为临床经验性用药提供指导。方法回顾性分析该院血液科病房从2009年1月至2012年12月送检临床血液标本中分离出来的菌株情况,培养采用BD9120全自动血液培养仪,药物敏感试验采用K-B法及VITEK 2 COMPACT的MIC法。结果 2009～2012年大肠埃希菌仍然是血液科血培养感染率最高的细菌,紧随其后的是凝固酶阴性的葡萄球菌和铜绿假单胞菌,同时各个细菌对常用的抗菌药物敏感性均逐年降低。结论血液科病房的血培养阳性率一直在全院是最高的,其感染菌分布以阴性菌为主,除去采样时的污染因素,凝固酶阴性的葡萄球菌也是血培养的常见菌,迫切需要规范临床合理用药。

MALDI-TOF质谱分析在临床微生物实验室的应用

基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱分析（MALDI-TOF MS）是一种新兴的软电离质谱分析,被用来绘制细菌及其他微生物的蛋白质质谱.这类质谱可以与已知的参考数据库进行比对,从而快速而准确的对微生物鉴定到属、种乃至某株.最近商品化的MALDI-TOF质谱仪发展迅猛,使得这项技术在欧洲可被用于临床微生物实验室的常规细菌诊断,这里就MALDI-TOF MS技术的原理和最新的发展做一简单综述.

主动痰与被动痰标本中病原菌的分布及药敏特点

目的比较主动痰标本与被动痰标本中菌群分布的差异及其药敏特点,以指导临床区别性经验用药。方法收集2015年1~6月期间在我院留取的980份培养阳性的合格痰标本,按留取方式分为主动痰标本500份,被动痰标本480份;对各组内菌种分布特点及组间药敏结果进行统计分析。结果主动痰标本和被动痰标本来源不同,前者主要来源为呼吸科(48.6%)和急诊病房(24.8%),后者主要来源于脑病中心(25.6%)和ICU病房(24.6%);主动痰标本和被动痰标本分离的致病菌种类也不同,主动痰中最常见的致病菌是肺炎克雷伯菌(34.0%),而被动痰标本中最常见的是铜绿假单胞菌(32.7%);两者所分离出的细菌的药敏结果也存在明显不同,被动痰标本中的细菌除了铜绿假单胞菌外,其余细菌对常用抗生素的耐药率均明显高于主动痰标本中分离出来的同种细菌,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论不同留取方式下的痰标本分离出的常见致病菌存在差异,这是由患者不同的临床病情所决定的,临床微生物实验室进行致病菌菌株和药敏统计时应充分考虑到留取方式的差异,进一步细化分类,而临床医生应根据患者不同的病情和留取方式选择不同的经验性用药。

几种简单易行的EB病毒转化外周血淋巴细胞建系方法的比较

目的比较几种EB病毒建系方法的可行性。方法利用EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转化淋巴细胞建系的四种方法:即微量全血法,冻存全血法,冻存白细胞法和环孢霉素A(CyA)法,对全血淋巴细胞进行转化建系。结果四种方法均可成功建系,按建系效率从高到低依次为:环孢霉素A法、冻存白细胞法、冻存全血法和微量全血法。结论在血量充足的情况下,建议选择环孢霉素A法进行建系。

嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明耐药的机制研究

目的：检测 I类整合酶基因（intI 1）及 qacE△1-sul1和 sul2基因在耐复方新诺明的嗜麦芽窄食单胞菌中的分布情况，并探讨基因分布与细菌耐药性的关系。方法收集临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌，煮沸法提取总 DNA，采用 PCR法检测 intI 1，qacE△1-sul1和 sul2基因在复方新诺明敏感菌株和耐药菌株中的分布情况。结果28株耐复方新诺明嗜麦芽窄食单胞菌中有25株检出 I类整合酶基因，检出率为89.29％；21株检出 qacE△1-sul1基因，检出率为75％；15株检出sul2基因，检出率为53.57％；18株复方新诺明敏感的嗜麦芽窄食单胞菌中有5株检出 I 类整合酶基因，检出率为27.78％，4株检出 qacE△1-sul1基因，检出率为22.22％，均未检出 sul2基因。结论耐复方新诺明嗜麦芽窄食单胞菌大部分携带有 intI 1，qacE△1-sul1和 sul2基因，嗜麦芽窄食单胞菌对复方新诺明的耐药性与 intI 1，qacE△1-sul1和 sul2的存在有关。

电感耦合等离子体质谱仪在血流感染早期诊断中的初步应用

目的使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)研究血流感染患者血清中的金属元素水平,探讨金属元素在血流感染患者血清中的浓度变化以及和感染病原菌之间的相关性,获得差异表达的金属元素图谱,评价将此类质谱仪应用于血流感染早期诊断的可行性。方法收集血流感染患者的血清作为血流感染组,同时分离出血液中的病原菌,按病原菌种类将标本分类,选用健康者血清作为阴性对照组。运用ICP-MS测定患者血清中各类金属元素含量的变化,使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)绘制金属元素图谱,寻找出浓度明显改变的金属元素,组间各金属元素的相关性研究使用Pearson相关性分析。结果一共建立了4个病原菌血流感染的金属元素图谱(包含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌和肺炎克雷伯菌),血流感染组与对照组间有浓度明显改变的金属元素,包括钯、金、钍、锡等;Pearson相关性分析显示这些金属元素与血流感染和感染菌种类之间均有相关性,如钙与金黄色葡萄球菌血流感染呈负相关性(r=-0.788),钯和金均与大肠埃希菌的血流感染呈正相关性(r=0.906、0.748)。结论从上述研究结果看,具有差异性的金属元素图谱可以作为血流感染早期诊断、预防和预后的潜在标志物,其应用性值得进一步的深入研究。