中间球海胆CS基因克隆及其响应急性高温胁迫的表达模式

【目的】明确中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)柠檬酸合酶(CS)基因(SiCS)的序列特征、组织表达情况及其应对急性高温胁迫的响应规律,为研究SiCS基因功能及揭示其参与中间球海胆高温应答的分子机制提供理论依据。【方法】利用RACE克隆SiCS基因cDNA序列,通过BLASTx、EXPASY Proteomics Server、HMMER、PSIRED v3.3及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析;然后采用分光光度法检测中间球海胆管足和性腺线粒体肿胀度,运用实时荧光定量PCR检测SiCS基因的组织表达规律,并以Epoch酶标仪测定中间球海胆管足和性腺总SiCS活性变化情况。【结果】SiCS基因cDNA序列全长2971 bp,5'端非编码区(5'-UTR)和3'端非编码区(3'-UTR)分别为96和1480 bp,开放阅读框(ORF)为1395 bp,共编码464个氨基酸残基。SiCS蛋白分子量约51.48 kD,理论等电点(pI)为6.09,总平均亲水性(GRAVY)为-0.178,为稳定的温和疏水性蛋白;SiCS蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,其二级结构中α-螺旋占43.86%、β-折叠占7.02%、无规则卷曲占49.12%,三维结构模型与野猪CS蛋白晶体结构的一致性为73.97%。SiCS氨基酸序列与紫球海胆(S.purpuratus)的CS氨基酸序列相似性最高,为92.90%。SiCS基因在中间球海胆的5种组织中均有表达,其相对表达量排序为体腔细胞>围口膜>性腺>管足>肠道;总SiCS活性排序则为管足>肠道>围口膜>性腺>体腔细胞;与对照组(20℃)相比,经23和26℃急性高温胁迫后中间球海胆管足和性腺的SiCS基因相对表达量及总SiCS活性均呈波动变化规律,但在不同高湿胁迫下和不同组织中有所差异。【结论】中间球海胆可能通过调整组织中的SiCS基因相对表达及SiCS活性来响应急性高温胁迫,且这种响应策略存在一定的组织和温度特异性,具体表现为性腺对急性高温胁迫较管足更敏感。

刺参精子冷冻保存方法研究

为获得适宜的刺参Apostichopus japonicus精子冷冻保存技术,综合借鉴现有水产动物精子冷冻保存方法,对刺参精子降温方式、冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度进行了筛选,在筛选出适宜的刺参精子降温方式基础上,分别以煮沸消毒海水和超纯水为溶剂,加入葡萄糖、NaCl、KCl、海藻糖、无水CaCl2和冷冻保存剂[二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Gly)或1,2-丙二醇(1,2-G)]配制冷冻保存剂终体积分数为5%、10%和15%的冷冻保存液(Aj-1~Aj-27),以体积比为1∶1、1∶2和1∶3的比例混合精子与冷冻保存液进行冷冻保存,冷冻48 h后分别在37℃和30℃水浴条件下进行精子复苏,以精子活率、快速运动时间和精子寿命为指标,综合筛选冷冻保存刺参精子的适宜冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度。结果表明:将刺参精子与以超纯水为溶剂配制的Aj-20精子冷冻保存液(12 g/L葡萄糖、7 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、5 g/L海藻糖、0.1 g/L无水CaCl2和终体积分数为10%的DMSO)以体积比为1∶2的比例混合,以三步法降温方式冷冻保存,并在30℃水浴短时迅速复苏,该技术方法为本研究筛选到的最优刺参精子冷冻保存方法;与本研究中其他冷冻技术方法相比,应用该优选方法冷冻保存的刺参精子在复苏后精子活率最大(19.00±4.00)%、快速运动时间最长(1178.67 s±14.57 s)、寿命最久(2817.33 s±93.76 s);应用该优选方法冷冻保存72、120、408 h的精子复苏后受精率可达70%以上(精子与卵子数量比为1×106∶1),受精的卵囊孵化率可达到50%。研究表明,本研究中筛选获得的冷冻保存液配方及其冷冻保存方法比较适宜刺参精子的长期冷冻保存,具有应用于生产实践的潜力。

棘皮动物线粒体基因组研究进展

线粒体基因组是存在于真核生物线粒体中的重要遗传物质,可独立进行复制、转录和蛋白质合成。与核基因组相比,线粒体基因组具有长度相对较短、点突变率高等特点,被认为是研究生物系统进化的重要对象之一。近年来,在海洋生物研究中,线粒体基因组已被广泛应用于遗传分析、种质鉴定、分子标记挖掘以及系统进化研究等领域并取得了丰富的成果。棘皮动物在全球海洋中分布广泛,属无脊椎动物的高等类群,也是无脊椎动物向脊椎动物进化的重要节点生物。目前已有97个物种完成了线粒体基因组的测序。棘皮动物的线粒体基因组包含37个基因,其中ND6基因均分布于轻链。海胆和海星的基因排列顺序最为保守。棘皮动物在绝大多数情况下会使用ATG作为起始密码子,使用TAA和TAG作为终止密码子。根据现有的线粒体基因组数据和分析方法可以阐明绝大多数棘皮动物的分类与系统进化关系,但仍有一些物种的分析结果缺乏足够的可信度。棘皮动物线粒体基因组研究尚有很多方面仍需进一步开展。

水产动物精原干细胞和胚胎干细胞冷冻保存技术研究进展

生殖细胞及胚胎的低温冷冻保存不仅是水产动物种质资源保存的重要技术手段之一,也是为水产动物优良新品种创制和培育提供基础育种材料的主要途径。精原干细胞和胚胎干细胞冷冻保存技术是近年来水产研究领域新兴的一种低温冷冻保存技术,与传统冷冻保存的精子或胚胎相比,冷冻保存的精原干细胞及胚胎干细胞具有自我更新及多向分化的潜能,同时还具有可以进行体外分化与移植等优势。本文综述了近年来水产动物精原干细胞和胚胎干细胞冷冻保存技术研究及其应用成果,以期进一步丰富和完善水产动物精子和胚胎冷冻及保存技术的资料体系,为充分利用低温冷冻保存技术提高水产经济动物优质种质资源保护和新种创制效率提供参考。

湖南二号方调节机体免疫防治新型冠状病毒肺炎的网络药理学研究

目的:应用网络药理学方法探究湖南二号方通过增强免疫力防治新型冠状病毒肺炎(COVID-19)感染的作用与机制。方法:通过TCMSP等数据库筛选湖南二号方主要有效成分和潜在治疗靶点,通过GeneCards等数据库获取疾病基因,并将药物相关靶点与疾病靶点相互映射,通过Cytoscape3.8.0可视化筛选出核心基因,对共有靶点进行蛋白质相互作用网络构建、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果:湖南二号方中药-成分-靶点-疾病网络包括5味中药、99种活性成分和73个疾病靶点。其中湖南二号方治疗新型冠状病毒肺炎的靶点主要包括IL-6、VEGFA、ALB、CXCL8、MMP9和AKT1等。GO功能富集分析共得到条目1962个,主要涉及氧化应激反应和活性氧代谢过程等。KEGG通路富集分析筛选出145条信号通路,包括HIF-1、PI3K-Akt、TNF等信号通路。结论:湖南二号方中的槲皮素、山奈酚、异鼠李素活性成分可能通过介导HIF-1、IL-17等多条信号通路影响IL-6、VEGFA、ALB、CXCL8等靶蛋白的表达,发挥防治COVID-19的作用。

湖南一号方通过作用于ACE2防治新型冠状病毒肺炎的网络药理学研究

目的:基于新型冠状病毒主要受体-血管紧张素转化酶2(ACE2)应用网络药理学方法探究湖南一号方防治新型冠状病毒肺炎的作用与机制。方法:应用中药系统药理分析平台(TCMSP)检索湖南一号方中活性成分,结合药物靶点数据库搜索新型冠状病毒肺炎相关靶点,采用Cytoscape平台构建中药-活性成分-靶点-疾病网络,运用STRING和DAVID数据库对靶点的相互作用网络、GO功能和KEGG通路进行分析。结果:湖南一号方中药-活性成分-靶点-疾病网络包括8味中药,120种活性成分和90个疾病靶点。其中湖南一号方防治新型冠状病毒肺炎的靶点主要包括ALB、IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK3、MMP9和CXCL8等。主要涉及生物过程中的氧化应激反应、活性氧代谢等,分子功能主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性等,细胞组分主要涉及膜筏、膜微区等。上述靶点主要是参与HIF-1信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等多条信号通路的调控。结论:湖南一号方可能通过介导HIF-1、IL-17等信号通路影响ALB、IL-6、VEGFA、CASP3等靶蛋白的表达,进而调节氧化应激反应、细胞因子活性等生物功能,发挥多成分-多靶点-多途径防治新型冠状病毒肺炎的作用。

雷公藤红素通过激活LXRα/ABCA1通路和细胞自噬抑制巨噬细胞脂质蓄积

巨噬细胞源性泡沫细胞转化被认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成与发展的早期变化,其细胞内蓄积的过量脂质可通过促进血管内膜生长与坏死核形成,继而诱发斑块破裂及血栓形成等严重后果.近期研究发现,雷公藤红素可显著调节脂质代谢,对泡沫细胞转化进程具有潜在的治疗意义.本研究表明,雷公藤红素(Celasrol,CeT)呈浓度依赖性减少巨噬细胞Raw264.7内的脂滴积蓄,并上调胆固醇转运关键分子ABCA1、LXRA蛋白质表达.进一步研究显示,CeT可逆转ABCA1敲低介导的脂质蓄积与ABCA1表达下调.此外,CeT处理Raw264.7细胞24 h时观察到自噬标志物LC3Ⅱ/Ⅰ增加、p62减少,且采用自噬抑制剂3MA可恢复细胞内脂质水平.综上,CeT可能通过上调LXRα/ABCA1信号及激活荷脂细胞自噬,抑制巨噬细胞内脂质蓄积.因此,深入探究CeT在巨噬细胞源性泡沫细胞转化及AS发生发展中的作用,是研究AS治疗新的着力点,并为药物干预提供新的靶点.

皮氏蛾螺形态性状对体质量与软体部质量的相关性及通径分析

为明确中国北方沿海自然皮氏蛾螺Volutharpa ampullacea Perryi群体形态性状对两种质量性状(体质量和软体部质量)的影响,对自然环境下采集的100个皮氏蛾螺的8个形态性状(壳高X_(1)、壳宽X_(2)、壳口高X_(3)、壳口宽X_(4)、体螺层高X_(5)、体螺层宽X_(6)、螺旋部高X_(7)和螺旋部宽X_(8))和2个质量性状(体质量Y_(1)和软体部质量Y_(2))进行了测量,采用相关性分析、通径分析和多元回归分析等方法研究了中国黄海北部皮氏蛾螺形态性状对其质量性状的影响。结果表明:皮氏蛾螺各性状间均呈极显著相关(P<0.01),其中,壳宽对体质量的影响最大,而体螺层高则对软体部质量影响最大;经多元回归分析,剔除对体质量影响不显著的形态性状,建立了以体质量为因变量,以形态性状为自变量的最优回归方程Y_(1)=-51.102+0.819X_(5)+0.792X_(3)+0.757X_(2)+0.593X_(8)(R^(2)=0.786);剔除对软体部质量影响不显著的形态性状,建立了以软体部质量为因变量,以形态性状为自变量的最优回归方程Y_(2)=-50.078+0.934X_(5)+0.544X_(2)+0.628X_(3)+0.621X_(7)(R^(2)=0.789)。研究表明,在以体质量为选择目标进行皮氏蛾螺的亲本选择时,应首先以壳宽为首要选择的性状,同时加强壳口高的协同选择;而在以软体部质量为选择目标进行皮氏蛾螺亲本选择时,则应首先以体螺层高为首要选择的性状,同时加强壳口高的协同选择。

皮氏蛾螺生物学研究进展

皮氏蛾螺Volutharpa ampullacea perryi腹足形似鲍鱼的腹足,故俗称“假鲍鱼”,是水产市场上常见的鲍鱼廉价“替代品”,是我国黄渤海沿岸常见的经济螺类。皮氏蛾螺营养丰富,还含有许多生物活性物质,在海洋药物、保健品和化妆品开发中具有较大的潜力。本文通过综述近年来国内外有关皮氏蛾螺生物学研究的新进展,进一步梳理了皮氏蛾螺的基础生物学研究数据,可为提高皮氏蛾螺的附加经济价值乃至新的海洋生物活性物质资源开发提供参考。

皮氏蛾螺黏液粗蛋白对肝癌细胞增殖及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

为明确皮氏蛾螺Volutharpa ampullacea Perryi黏液粗蛋白的抗肿瘤作用,以人肝癌细胞Hep-G2和H荷瘤小鼠为研究对象,采用显微观察、流式细胞术和qRT-PCR等方法,通过体外和体内试验,分析了皮氏蛾螺黏液粗蛋白对人肝癌细胞Hep-G2增殖及H荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。结果表明:与未经处理的对照组相比,0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理组Hep-G2细胞在形态上呈现变形严重、核浓缩且核膜模糊、胞质出现空泡、线粒体肿胀及细胞表面微绒毛显著减少等现象;0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理组Hep-G2细胞中G2/M期细胞比例显著高于对照组(P<0.05);0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白处理12 h时,小鼠Hep-G2细胞中的细胞周期蛋白基因(CCNB1)和细胞周期蛋白依赖性激酶基因(CDK1)相对表达水平显著低于对照组(P<0.05);0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射组(预防组和治疗组,注射剂量为30 mg/kg)荷瘤小鼠体内肿瘤的平均质量极显著低于模型对照组(P<0.01)。研究表明,皮氏蛾螺黏液粗蛋白在体内外均有抗肝癌作用,具有成为海洋源抗肝癌药物的开发潜力。

仿刺参Akt基因的克隆及其表达和生物功能分析

为了初步明确仿刺参中Akt基因的序列信息、进化特点以及生物功能,本研究利用分子生物学手段获得了仿刺参Akt基因(AjAkt)的cDNA全长,并,对该基因的序列特征、组织表达规律以及对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)刺激的响应规律进行了研究。结果显示,AjAkt全长1828 bp,其中,开放阅读框(open reading frame,ORF)的长度为1434 bp,编码477个氨基酸,5’非翻译区(5’-UTR)和3’非翻译区(3’-UTR)的长度分别为188 bp和204 bp。预测的AjAkt蛋白的相对分子质量为55.47 kD,等电点(pI)为5.43。序列分析显示,AjAkt含有丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶即蛋白激酶B家族的3个特征性结构域,轻度亲水且无跨膜结构及信号肽。同源性分析表明,AjAkt的氨基酸序列与蓝海燕(Asterina pectinifera)的Akt相似性最高(65.9%)。基因相对表达分析结果显示,AjAkt在仿刺参呼吸树、肠、体壁、纵向肌肉、体腔细胞及管足中均有表达。其中,体腔细胞和肠中AjAkt的相对表达量显著高于其他4种组织(p<0.05)。灿烂弧菌感染实验发现,与对照组相比,AjAkt在成体仿刺参体腔细胞中的相对表达量在感染后的第4 h至第72 h呈现极显著上调趋势(p<0.01),其中两个相对表达高峰分别出现在感染后的第4 h和第72 h。本研究结果可进一步丰富棘皮类Akt基因的序列信息及进化数据,为深入研究该基因的生物学功能提供参考资料。

光棘球海胆TGFBR2基因的克隆及其对海水酸化的响应

为了探究光棘球海胆(Mesocentrotus nudus)转化生长因子-βⅡ型受体(Transforming growth factor-βreceptor typeⅡ,TGFBR2)基因的序列信息及其响应海水酸化的模式和规律。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)首次获得光棘球海胆TGFBR2基因(MnTGFBR2)的cDNA全长序列。结果显示:该基因全长为2260 bp,其中5’非编码区长度为227 bp,3’非编码区长度为254 bp,开放阅读框长度为1776 bp,编码一个含592个氨基酸的多肽。MnTGFBR2蛋白理论分子量为66.11 kD,理论等电点为5.30。同源性及系统进化分析显示,Mn TGFBR2蛋白与紫球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)TGFBR2蛋白聚为最近的一支,二者序列一致性高达95.97%。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,MnTGFBR2在管足、围口膜、体腔液、肠和性腺5种组织中均有表达,其相对表达量从高到低依次为:管足>围口膜>体腔液>肠>性腺。海水酸化处理实验发现,随着酸化时间的延长,与自然海水组相比,当海水pH值下降0.3个单位时,光棘球海胆性腺组织和肠组织中MnTGFBR2的相对表达均呈先极显著降低(p<0.01)后升高的趋势;当海水pH值下降0.4个单位时,光棘球海胆性腺组织中MnTGFBR2的相对表达呈先极显著降低(p<0.01)后升高再降低的趋势,而肠组织中MnTGFBR2的相对表达则一直呈现极显著降低趋势(p<0.01);当海水pH值下降0.5个单位时,光棘球海胆性腺组织中MnTGFBR2的相对表达呈先极显著降低(p<0.01)再升高的趋势,而肠组织中MnTGFBR2的相对表达则呈显著降低(p<0.05)的趋势。

海胆和海参中microRNAs的研究进展

MicroRNAs(MiRNAs)是一种长度为20 nt左右的内源调控型非编码RNA,主要参与基因的转录后调控,在真核生物的生长发育、细胞分化和免疫防御等过程中发挥重要作用。海胆和海参属棘皮类动物,是高等的海洋无脊椎动物,它们不仅是研究无脊椎动物向脊椎动物进化的重要模式生物,其中的一些种类还是重要的渔业资源,具有较高的经济价值。近年来,探明各类miRNAs在海胆和海参生长发育及生理代谢过程中的调控功能及调控机制已逐渐成为海胆和海参研究领域的热点。本研究中综述了近年来海胆和海参中miRNAs的研究成果和相关进展,以期进一步丰富和完善海胆和海参中miRNAs的基础资料,为系统了解和掌握海胆和海参中miRNAs的序列特点、生物学功能及其参与调控重要生理过程的分子机制提供参考资料。

水产动物“miRNA-靶基因”模体(motif)生物功能研究进展

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类内源性的、长度在19~25个核苷酸的单链非编码小RNA分子,在生物体内主要参与基因转录后水平的表达调控。研究证实,同一miRNA可以靶向多种不同的基因,同一基因也可以由多个miRNAs调控,miRNA与其靶基因形成的互作模体(motifs)不仅可以调控生物的生长发育,在生殖、代谢和疾病发生等多个方面也具有重要的作用。本研究从miRNA靶基因的鉴定,miRNA调控靶基因的方式以及水产动物中“miRNA-靶基因”模体的研究进展3个方面进行综述,旨在为系统掌握水产动物miRNA对其靶基因的调控特点及规律,探讨水产动物中“miRNA-靶基因”模体参与水产动物重要生理生化过程的分子机制提供更多参考。

基于网络药理学探讨莓茶作用于ACE2防治新型冠状病毒肺炎的潜在机制

目的:应用网络药理学方法探究莓茶作用于新型冠状病毒主要受体-血管紧张素转化酶2(ACE2)防治新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的作用与机制。方法:在TCMSP数据库中检索出莓茶活性成分,在NCBI Gene等数据库找到疾病相关靶点,在Cytoscape平台筛选出莓茶和疾病的共有靶点,使用STRING和DAVID数据库分析共有靶点的蛋白质相互作用网络、基因本体论(GO)功能和基因组百科全书(KEGG)通路。结果:莓茶-活性成分-靶点-疾病网络含26种活性成分和71个共有靶点。莓茶防治疾病的靶点主要包括白细胞介素6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和胱天蛋白酶3(CASP3)等。得到1447个GO条目,主要涉及氧化应激反应、活性氧代谢过程等,得到106条KEGG通路富集结果,主要有晚期糖基化终末化产物及其受体(AGE-RAGE)、缺氧诱导因子1(HIF-1)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)等信号通路。结论:莓茶可能通过介导AGE-RAGE、HIF-1等多条信号通路,影响ACE2、IL-6、VEGFA等蛋白的表达,调节病毒受体与配体相互作用、氧化应激反应、活性氧代谢等生物功能,故可为防治新型冠状病毒肺炎提供潜在应用价值。