血小板聚集功能的新检测方法和仪器的性能评价及临床应用

本研究旨在评价对血小板聚集功能检测的新方法及仪器的性能,并建立其参考区间,探讨其临床应用价值。按照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的仪器性能验证标准和美国《临床实验室改进修正法案-88》(Clinical Laboratory Improvement Amendment 88,CLIA’88法案)制定的评价标准,对PL-11血小板分析仪进行了分析性能评估。用PL-11血小板分析仪测试健康志愿者柠檬酸钠静脉抗凝血的聚集功能,并对测定结果进行统计分析,建立PL-11血小板分析仪本实验室的参考区间。同时收集本院神经内科急性脑梗死(ACI)患者服用氯吡格雷7 d前后血小板最大聚集率(MAR)的变化来探讨PL-11血小板分析仪的临床诊断意义。结果表明,各参数皆符合CLIA'88法案的要求。测得PLR-06、PLR-07、PLR-09、PLR-10血小板诱聚剂诱导的247名健康正常人血小板MAR分别为58.8±10.1(﹪)、61.2±11.8(﹪)、51±10.2(﹪)、53.1±9.2(﹪)。ACI患者MAR在服用氯吡格雷后明显降低。结论:PL-11血小板分析仪检测结果准确可靠,是一种较理想的适用于血栓病早期预警和诊断的新型血小板聚集功能检测仪,值得推广应用。

免疫性血小板减少性紫癜患者血浆协同刺激分子B7-H2和B7-H3与血小板自身抗体之间的相关性分析

目的:探讨免疫性血小板减少性紫癜(ITP)患者血浆中的协同刺激分子B7-H2和B7-H3与血小板膜糖蛋白自身抗体水平之间是否具有相关性。方法:选取2012年6月至2013年8月期间于苏州大学附属第一医院就诊的ITP患者61例及同期健康体检者25例,通过流式免疫微球(FCIA)方法检测血浆中血小板5种糖蛋白(GPⅨ、GPⅠb、GPⅢa、GPⅡb及P选择素)的自身抗体,同时采用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测血浆中可溶性协同刺激分子B7-H2(s B7-H2)和B7-H3(s B7-H3)水平,采用SPSS软件进行统计分析。结果:ITP患者血浆中5种血小板膜糖蛋白的自身抗体水平明显升高(P<0.01);ITP患者血浆s B7-H2水平升高(P<0.05),s B7-H3无明显变化;相关性分析显示,s B7-H3与血小板P-选择素自身抗体呈负相关(r=-0.46,P<0.05),并且s B7-H2和s B7-H3水平在P-选择素自身抗体阳性的ITP患者中降低(P<0.05);ITP患者血小板计数与s B7-H2水平之间呈负相关(r=-0.3907,P<0.01)。结论:ITP患者血浆中可溶性协同刺激分子s B7-H2升高,s B7-H3水平与P选择素自身抗体有关,提示协同刺激分子B7-H2和B7-H3可能参与了ITP自身免疫的病理机制。

定量检测血小板特异性抗体的流式免疫微珠芯片技术的建立及其临床应用

目的:建立流式免疫微珠芯片技术(FCIA)定量检测血小板特异性抗体的方法,探讨其在ITP诊治中的应用。方法:通过已知浓度的人IgG结合在包被抗体的微珠上,构建定量标准曲线,同时使用5种抗血小板GPIX(SZ1)、GPIb(SZ2)、GPIIIa(SZ21)、GPIIb(SZ22)和P-选择素(SZ51)抗体包被的微珠捕获血小板特异性抗原抗体复合物进行血小板抗体的检测。通过定量标准曲线将流式细胞仪检测的荧光信号转换成样品中血小板抗体浓度,从而建立定量检测血浆样品中血小板特异性抗体的方法(FCIA),并对该方法从性能、效率,临床应用等方面进行评价。结果:针对GPIX、GPIb、GPIIIa、GPIIb和P-选择素5种抗体的FCIA定量检测范围分别为33.29-1280、45.17-1280、42.07-1280、46.40-1280和42.48-1280 ng/ml,回收率分别为115.23%、112.58%、117.47%、107.64%和112.67%。批内精密度(CV%)分别为3.54%、3.65%、4.66%、6.43%和6.97%,批间精密度(CV%)分别为10.89%、7.57%、10.34%、6.95%和10.72%。ITP组5种血小板特异性抗体浓度值均高于NITP和健康对照组(P<0.01)。FCIA定量检测5种抗体对诊断ITP的灵敏度、特异性和准确度分别为68.29%,84.93%和78.95%,而改良间接MAIPA技术检测的相应值分别为41.46%、90.41%和72.81%。结论:建立的血小板特异性抗体FCIA定量检测方法为ITP的诊断、疗效评估、患者预后提供了一个良好工具。

Matriptase-2多克隆抗体的制备及鉴定

目的：探讨Matriptase-2重组蛋白的表达及多克隆抗体制备。方法 Matriptase-2胞外区近跨膜段（Glu81-Gly228）克隆入pMAL-C2X，重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌，经IPTG诱导表达，提取细菌蛋白后用直链淀粉树脂纯化柱进行纯化。将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备Matriptase-2抗血清；免疫血清用protein G亲和层析柱进行纯化，获得多克隆抗体。结果成功表达了Matriptase-2重组融合蛋白，获得了高效价的抗血清，Western blot结果显示具有抗原特异性识别。结论成功制备了高特异性、高效价的抗人Matriptase-2多克隆抗体，为今后深入研究Matriptase-2的生物学功能提供了有用的实验工具。

血小板聚集机能检测的新方法及仪器的性能评价

目的对血小板聚集机能检测的新方法及仪器的性能进行评价并报告。方法按照国际血液学标准华委员会（ICSH）制定的评价标准进行。用EDTA．K2及柠檬酸钠静脉抗凝血测试血小板分析仪的批内重复性、日间重复性、携带污染率、准确性及线性性能，并与MPG．3E多功能双通道血液凝聚仪测定结果进行相关分析。结果各参数皆符合ICSH的要求。血小板分析仪批内、日间精密度的CV均〈5％；携带污染率〈1％；测定定值全血质控物，准确性满意，线性良好；测定结果与光密度比浊法结果相关性分析，R^2=0．9439。结论新型血小板分析仪的批内重复性、日间重复性、携带污染率、准确性、线性及比较实验均较好，报告结果准确可靠。新型血小板分析仪是一种较理想的适用于血栓病早期预警和诊断的新型血小板聚集机能检测仪，值得推广应用。

疏血通注射液体外抗栓及抗凝作用研究

目的探讨疏血通注射液(以下简称疏血通)体外抗凝、抗栓作用。方法 2015年5—7月,收集来自江苏省血液研究所的6例健康献血者的外周血,采用同一健康献血者的血液或血浆,以疏血通1份+血液或血浆9份作为加药组,0.9%氯化钠溶液1份+血液或血浆9份作为对照组。检测两组血常规指标、凝血指标、纤溶指标、血小板功能、体外血栓形成情况。结果对照组白细胞计数、血小板计数高于加药组(P<0.05)。两组红细胞计数、红细胞比容比较,差异无统计学意义(P>0.05)。加药组活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)长于对照组(P<0.001);对照组与加药组血块收缩率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。纠正试验的APTT、PT、TT长于对照组(P<0.05);纠正试验的APTT、PT、TT短于加药组(P<0.05)。加药组D-二聚体、组织纤溶酶原激活物(t-PA)高于对照组,纤酶蛋白原(FIB)、优球蛋白溶解时间(ELT)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)低于对照组(P<0.05)。加药组ADP、瑞斯托霉素、胶原、凝血酶诱导的血小板聚集率均低于对照组(P<0.05);两组血小板黏附率比较,差异无统计学意义(P>0.05);加药组P-选择素高于对照组(P<0.05)。加药组R值、K值长于对照组,α角、MA值小于对照组(P<0.05)。结论疏血通在体外实验中显示出一定的抗凝、促纤溶、抑制血小板聚集和抑制血栓形成的作用。

三七抗血小板聚集及抗凝作用机制研究

目的:探讨中药三七抗血小板聚集和抗凝的作用机制。方法:征集10例志愿者,每日口服三七3 g,连续服用5日。比较服药前后经由胶原(collgen,COL)、肾上腺素(epinephrine,EPI)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)和花生四烯酸(arachidonic acid,AA)所诱导的血小板聚集率(maximum platelet aggregation rate,MAR),比较血浆中血管性血友病因子抗原(von willebrand factor antigen,VWF:Ag)、P-选择素(Pselectin)含量,凝血酶时间(thrombin time,TT),活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)及凝血酶原时间(prothrombin time,PT)。结果:与服药前相比,MAR在第3、6日均显著下降(P<0.05),服药后第6日血浆VWF:Ag和P-选择素的含量显著下降(P<0.05),服药后第6日,TT、APTT、PT均延长(P<0.05)。结论:三七主要通过抑制血小板黏附、聚集和释放的作用起到抗血栓的作用,兼有抗凝作用。

VWF前导肽对D1区VWF突变体的作用机制研究

目的:探讨野生型VWFpp与前导肽D1区VWF突变体共转染是否能纠正D1区突变引起的VWF缺陷。方法:将4个定点诱变的VWF D1区突变体质粒单独瞬时转染HEK 293细胞;VWF D1区突变体质粒与VWFpp质粒共同瞬时转染HEK 293细胞,通过ELISA、垂直多聚体电泳分析细胞上清液及裂解液中的VWF,免疫荧光共聚焦显微镜下观察细胞内质网中VWF的滞留。结果:在垂直多聚体分析中,VWF突变体和VWFpp共表达后VWF多聚体条带消失。共表达后,无论是细胞上清液还是裂解液中VWF抗原含量均减少。在免疫荧光共聚焦显微镜下,共表达后,虽然细胞内VWF含量减少,但VWF在内质网滞留比率下降。结论:VWFpp虽然能减少D1区VWF突变体在内质网的滞留,促进了VWF在亚细胞器间的转运,但进一步抑制了D1区突变体VWF的合成及分泌。

高通量法测定血小板自身抗体的含量及临床意义

建立高通量流式细胞检测法测定免疫性血小板减少症(ITP)患者血浆中的自身抗体,探索其在疾病中的临床意义。首先将鼠源性抗血小板膜糖蛋白(GP)Ⅸ、抗GPⅠb、抗GPⅢa、抗GPⅡb和抗P-选择素的单克隆抗体分别包被于自身带有5种不同强度APC-cy7荧光的聚苯乙烯微球上,用流式细胞仪检测。建立受试者工作特征曲线评价该方法的特异度、灵敏度以及批内、批间差异。5种单克隆抗体检测的批内变异系数分别为8.35%、5.65%、3.41%、3.63%和3.51%。批间变异系数分别为10.10%、9.13%、8.04%、9.59%和10.20%。敏感度、特异度和精密度:抗GPⅨ分别为71.0%、80.4%和73.5%;抗GPⅠb分别为82.1%、80.8%和81.8%;抗GPⅢa分别为71.7%、79.2%和73.7%;抗GPⅡb分别为71.0%、76.7%和72.5%;抗P-选择素分别为72.0%、79.2%和74.0%;5种抗体联合检测分别为89.0%、66.5%和82.9%。利用本方法检测了75例口服地塞米松ITP患者治疗前后的自身抗体水平高低。成功建立一种基于流式微球技术特异性检测免疫性血小板减少性紫癜患者体内针对血小板膜糖蛋白自身抗体新的诊断方法。

家族性蛋白C与蛋白S基因联合杂合突变家系的基因变异特点与临床特征分析

目的:对1个蛋白C和蛋白S基因联合杂合突变的家系进行各项抗凝功能检测、基因诊断及临床特征分析。序法(Sanger测序法)检测基因突变。结果:在该家系中发现多人为遗传性蛋白C与蛋白S联合杂合突变,其中6位家族成员伴有深静脉血栓症状。结合家族中各成员的相关基因变异特点和临床表现,分析了遗传因素和继发性因素对该家系成员静脉血栓发病的影响。结果显示该家系中,蛋白C与蛋白S基因联合缺陷携带者有更高的静脉血栓发生率,但后天继发性因素仍对其最终是否出现血栓症状起重要作用。结论:静脉血栓形成是多因素导致的疾病,蛋白C合并蛋白S基因联合杂合突变是重要的遗传因素,临床上具有较大的异质性,继发性因素使静脉血栓栓塞症的发生率提高。

PL-11血小板分析仪检测功能的性能评价

目的评价PL-11血小板分析仪的分析性能。方法用EDTA．K2及柠檬酸钠静脉抗凝血，测试PL-11血小板分析仪的批内重复性、日间重复性、携带污染率、准确性及线性性能，并选择2012年2月至7月苏州大学附属第一医院门诊30位体检者的空腹柠檬酸钠静脉抗凝血与MPG-3E多功能双通道血液凝聚仪测定结果进行相关分析。结果各参数皆符合ELIA’88法案的要求。PL．11血小板分析仪批内、日间精密度的CV均〈5％；携带污染率〈1％；测定定值全血质控物，准确性满意，线性良好；测定结果与光电比浊法结果相关性分析，R2=0．9439。结论PL-11血小板分析仪可直接使用全血动态分析血小板聚集过程并能对血液细胞的多种组分（包括血小板和红细胞）进行定量分析，报告结果准确可靠。

流式免疫微球芯片技术检测血小板膜糖蛋白特异性自身抗体的方法及其临床应用

目的建立流式免疫微球芯片技术(FCIBA)检测血小板膜糖蛋白(GP)特异性自身抗体的方法及其临床应用。方法使用流式细胞仪检测包被不同GP的单克隆抗体,抗GPⅨ(SZ1)、抗GPⅠb(SZ2)、抗GPⅢa(SZ21)、抗GPⅡb(SZ22)、抗P-选择素(SZ51)的不同荧光强度的微球,检测结果与单克隆抗体俘获血小板抗原技术(MAI-PA)进行比较。选取特发性血小板减少性紫癜(ITP)组、非ITP(NITP)组和健康人对照组样本用FCIBA分析SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51共5种特异性血小板自身抗体。结果批内批间差异小;ITP组与NITP组和健康人对照组比较,差异均有高度统计学意义(均P<0.01);对ITP诊断的总特异度为81.4%(70/86),MAIPA总特异度为80.2%(69/86),差异无统计学意义(P>0.05)。敏感度为62.00%(31/50),明显高于改良间接MAIPA的31.00%(19/50,P<0.05)。结论 FCIBA可以一次同时进行5种自身抗体的联合检测,为ITP的临床诊断提供了一种快速测定的新方法。