琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV P24抗原适配体

建立以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,快速筛选高特异性、高亲和力的HIV P24抗原适配体的方法.利用消减SELEX技术及靶标替换的方法,以HIV P24抗原作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,进行6轮筛选,筛选到3条特异性核酸适配体.特异性检测表明,筛选得到的HIV P24抗原适配体与HIV P24抗原的结合解离常数均在纳摩尔级水平.该方法为HIV早期检测提供了新的检测技术,对适配体与靶分子相互作用机理的研究具有重要价值.

胃癌血清适配体的筛选及其鉴定

目的 :以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,利用RT-PCR和靶标替换消减SELEX技术从胃癌血清中筛选得到高特异性、强亲和力的适配体。方法:以离心超滤(50 000超滤管)法处理后的胃癌血清作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,先将寡核苷酸文库与反筛磁珠(结合正常血清)结合,取上清再与筛选磁珠(结合胃癌血清)结合,洗去未结合的寡核苷酸分子,对结合在磁珠上的寡核苷酸分子进行分离和扩增,λ酶切法制备ss DNA次级库,进行10轮筛选,将第10轮的文库扩增得到ds DNA,利用胶回收试剂盒回收纯化目的片段的ds DNA,并与p MDTM18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,测序获得适配体序列,同时用流式细胞术测定胃癌血清适配体的Kd值。结果:经过10轮筛选后,得到20条与胃癌血清结合的适配体。结论:特异性检测表明,筛选得到的胃癌血清适配体与胃癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中5、7、16、17、18号适配体能高特异性、强亲和力结合胃癌血清,与正常人血清不结合。该研究为胃癌的早期诊断提供了实验基础。

癌胚抗原特异性单克隆抗体(Anti-CEA)核酸适配体的筛选

目的 :筛选癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单克隆抗体(Anti-CEA)的核酸适配体(aptamers),为肺癌血清肿瘤标志物核酸适配体的筛选奠定实验基础。方法:利用羧基化琼脂磁珠作为筛选介质,以Anti-CEA为筛选的目标靶分子,通过消减SELEX技术及实时定量PCR技术,从随机ss DNA文库中筛选出与Anti-CEA特异性结合的aptamers,并通过凝胶阻滞实验(EMSA)鉴定筛选到的Anti-CEA-aptamer复合物,然后将得到的第10轮富集文库扩增为双链DNA,通过切胶纯化后,连接PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,同时利用交错PCR技术鉴定阳性克隆,经测序,获得aptamers的序列。结果:经过10轮筛选得到了4条与Anti-CEA结合的aptamers,测序结果显示均为不同序列。结论:验证筛选出的与Anti-CEA结合的aptamer,特异性检测结果表明2号aptamer与靶分子结合的特异性很高,且与非特异蛋白无明显吸附,筛选出的aptamers用于识别Anti-CEA,将为肺癌的早期诊断和早期治疗提供新的突破口。

肝癌血清肿瘤标志物适配体的筛选及其亲和力和特异性的鉴定

目的:采用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选获得一组已知和未知肝癌血清肿瘤标志物的适配体,为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法。方法:收集50例首次经诊断证实为原发性肝癌的患者血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体。先将磁珠-正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠-肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD18-T载体连接进行转化、挑选单克隆送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值)。结果:经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个。特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-1、Seq-16、Seq-17、Seq-56、Seq-72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91%以上。结论:利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与肝癌患者血清特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗肝癌血清的能力,有可能为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法。

肺癌患者血清特异性核酸适配体的筛选及鉴定

目的以磁珠为筛选介质,利用实时定量-PCR和消减SELEX技术从肺癌血清中筛选得到高特异性、强亲和力的肺癌血清核酸适配体。方法以磁珠为载体、肺癌病人血清为筛选的靶标分子,通过消减SELEX技术及实时定量PCR技术,从随机ss DNA文库中筛选出与肺癌血清特异性结合的aptamers,将得到的第9轮富集文库扩增为ds DNA,送上海生工直接对筛选得到的核酸适配体库进行高通量测序。结果经过9轮筛选得到4条与肺癌血清高特异性结合的aptamers,测序结果显示均为不同序列。结论验证筛选出的与肺癌血清结合的aptamer,特异性检测表明,筛选得到的肺癌血清核酸适配体与肺癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-2、Seq-3、Seq-6、Seq-19号核酸适配体能高特异性结合肺癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肺癌血清和200例正常人血清进一步鉴定4条肺癌血清核酸适配体检出肺癌的阳性率,阳性检出率达91%以上,为肺癌的早期诊断提供了新方法。

肺癌肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶抗原适配子的筛选及其应用

目的提出一种基于适配子快速检测肺癌肿瘤标志物的方法。方法利用指数级富集配体的系统进化技术筛选其高特异性适配子,通过流式细胞术检测亲和力,最终选出一条高亲和力、强特异性的适配子。枸橼酸钠还原法制备纳米金颗粒。建立基于免标记纳米金和适配子的分析方法,并对其方法进行考察。结果通过6轮筛选得到三条NSE的高特异性、强亲和力的适配子,其中,a适配子特异性最高。同时利用筛选得到的肺癌肿瘤标志物a适配子和纳米金颗粒建立一种快速检测NSE抗原的方法。结论该方法具有较好的准确度,为肺癌的早期检测提供了一种新的手段。

NF-κB信号通路研究进展

转录因子NF-κB作为一个标准的可诱导的转录因子已经超过20年了。众多的可激活NF-κB的刺激,以及大量的受NF-κB调节的基因,确保了这一转录因子仍然是研究热点。在这里,我试图总结一下从这些NF-κB的研究中所浮现出的一些基本规律,并希望能找出一个较统一的关于NF-κB调节的观点。

肿瘤标志物癌胚抗原及细胞角蛋白19片段对早期肺癌的诊断价值

在影像学的研究中,有时很难区分肺癌与肺良性疾病。在区别早期肺癌与肺良性疾病时,我们对两个常用的肿瘤标志物的诊断价值进行了评估。临床对655例肺癌病人及237例肺良性疾病患者血清中癌胚抗原(CEA)及细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)的水平进行了回顾性分析,其CEA以及CYFRA21-1的阳性值分别为3.2 ng/m L和3.5 ng/m L或者是其各自水平的两倍(6.4 ng/m L和7.0 ng/m L)。CEA及CYFRA21-1的水平在肺良性疾病患者中分别提高了32%和11%。CEA诊断肺癌的灵敏度和特异性分别是69%和68%,而CYFRA21-1则分别是43%和89%。因此,采取两种肿瘤标志物的联合诊断检测相对于单一标志物的检测其特异性更高。根据患者的住院状况以及患病率将其分组。其住院病人中肺癌的患病率为51%,门诊病人中肺癌的患病率为12%,正常人群中肺癌的患病率是0.1%。阳性预测值(PPVs)通过贝叶斯定理计算,并随着血清肿瘤标志物和患病率变化而变化。住院病人CEA的PPVs为69.2%,门诊病人CEA的PPVs为22.7%,在正常人群中CEA的PPVs为0.22%。而住院病人其CYFRA21-1的PPVs为80.3%,门诊病人的CYFRA21-1的PPVs为34.8%,正常人群的CYFRA21-1的PPVs为0.39%。然而,在51%的患者中,如果病人血清中表达的CEA及CYFRA21-1的阳性值很高,甚至达到它们各自水平的两倍时,它们对肺癌的诊断率为87.3%或更高。我们的结果表明:当采用联合诊断检测或者其水平达到单一检测正常参考值上限的两倍时,CEA及CYFRA21-1是除CT扫描外诊断肺癌有价值的肿瘤标志物。因此,患病率应该考虑将这些血清肿瘤标志物作为肺癌诊断的工具。

阻断大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化与肿瘤发生相关性研究

【目的】分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件.阻断正常干细胞的分化过程,探讨肿瘤发生机理.【方法】利用贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛联合诱导大鼠BMSCs,使其分化为脂肪细胞.在细胞分化过程中利用3-甲基胆蒽(3-MC)阻断大鼠BMSCs的分化过程.【结果】大鼠BMSCs分化试验显示:诱导30d后经油红O染色,细胞内可见脂肪细胞特有的红色脂滴沉淀,并且随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加,脂滴增大,表明大鼠BMSCs已成功分化为脂肪细胞.大鼠BMSCs分化阻断试验显示:诱导30d后经油红O染色细胞内红色脂滴沉淀明显下降,表明阻断后的细胞具有脂肪细胞的特性,但分化不完全;形态学鉴定表现出:细胞接触抑制消失,细胞核异常,微核畸变率高,核型异常,表明阻断后的干细胞发生恶性转变.【结论】通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛的联合作用,诱导BMSCs成功向脂肪细胞分化.在BMSCs向脂肪细胞分化的过程中加入阻断剂3-MC,阻断其分化过程,表明干细胞分化过程受到阻断,细胞停止在分化的中间阶段,有转化成肿瘤细胞的趋势.

肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体的筛选及其鉴定

目的筛选和鉴定肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体(Apt)。方法采用配体指数级富集系统进化(SELEX)技术,以DKK1为靶蛋白,羧基化琼脂磁珠为筛选介质,从随机ssDNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适体。利用生物信息学方法对核酸适体进行序列分析和二级结构预测,表面等离子体共振仪分析测定核酸适体的亲和力。结果经过6轮消减SELEX筛选,次级ssDNA文库与DKK1靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第6轮筛选产物经PCR扩增进行高通量测序。表面等离子体共振仪检测结果表明,筛选得到的DKK1核酸适体与DKK1的结合解离常数均在纳摩尔级水平,Apt-5的Kd值最小,亲和力最高,Apt-26和Apt-28核酸适体亲和力相对较弱。二级结构预测分析表明,茎环和茎凸环结构为主要的结构形式。圆二色光谱分析结果显示,3个候选核酸适体(Apt-5,Apt-26,Apt-28)能特异形成G-四链体结构识别DKK1靶标蛋白。结论获得了与DKK1靶标蛋白特异性结合的核酸适体,为后续核酸适体的应用研究以及DKK1蛋白功能的研究奠定了基础。

CA125抗原核酸适体的筛选及鉴定

目的建立一种基于核酸适体快速检测肿瘤血清标志物CA125抗原的方法。方法以CA125抗原为筛选靶标,CA199抗原为反筛选靶标,羧基化琼脂磁珠为筛选介质,利用指数级富集配体的系统进化技术筛选其高特异性核酸适体,利用生物信息学方法对核酸适体进行序列分析和二级结构预测,荧光定量法分析核酸适体的亲和力,ELONA法测定核酸适体的特异性。结果经过6轮消减SELEX筛选,次级ssDNA文库的亲和力逐渐提高,特异性次级ssDNA文库逐轮富集,经二代测序,获得3条拷贝数>1000的核酸序列(Apt-1、Apt-2、Apt-3),可特异性识别CA125抗原,测定Kd值,分别为41.02±4.9、19.06±9.0、10.02±5.0 nmol/L,Apt-3亲和力最高。结论功能性核酸适体Apt-3能高特异性识别CA125抗原,为肿瘤血清标志物CA125检测提供了一种新的、快速、有效的工具和手段。