鸡TIFA和TRAF6蛋白的分子特征及其基因在免疫器官中的表达特性

【目的】明确鸡肿瘤坏死因子受体相关因子相互作用的具有叉形头相关结构域蛋白(TIFA)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的分子特征及其基因在鸡免疫器官中的表达特性,为后续深入研究TIFA和TRAF6相互作用调控家禽病毒NDV复制的作用机制提供理论依据。【方法】采用生物信息学软件结合实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,通过分析鸡TIFA和TRAF6蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、氨基酸同源性和结构域保守性及其在1~6月龄白来航鸡和新城疫病毒(NDV)感染SPF鸡后第3~5天的免疫器官(脾脏、胸腺和法氏囊),分别检测鸡免疫器官中TIFA和TRAF6基因的表达水平,进而研究鸡TIFA和TRAF6蛋白的分子特征及其基因在免疫器官中的表达特性。【结果】鸡TIFA和TRAF6蛋白分别含有187和545个氨基酸残基,相对分子量约为21.8和61.9 kDa,其二级结构均主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。氨基酸同源性分析结果表明,鸡与火鸡TIFA和TRAF6蛋白的氨基酸同源性最高,分别为97.3%和98.2%,而与猪TIFA及小鼠TRAF6蛋白的氨基酸同源性最低,分别为51.1%和74.7%。同时,鸡TIFA蛋白的FHA结构域及TRAF6蛋白的RING、Zinc finger和MATH结构域均在禽类中保守性高。RT-qPCR分析结果表明,鸡TIFA和TRAF6基因在1~6月龄鸡免疫器官中均存在表达,但在脾脏中的相对表达量最高(47.94和10.84),而在法氏囊中最低(8.08和2.01),其中,TIFA基因在1月龄鸡免疫器官中表达量最高(22.15),在6月龄时最低(1.11),呈先减后增再减趋势,整体表达趋势呈倒“N”型模式;TRAF6基因在4月龄鸡免疫器官中表达量最高(7.13),在5月龄时最低(1.05),呈先降后升再降再升趋势,整体表达趋势呈“W”型模式。在NDV感染SPF鸡后的免疫器官中,TIFA和TRAF6基因的相对表达量均显著高于对照,其中,TIFA基因在第3天的鸡脾脏、第4天的鸡胸腺和法氏囊中的表达量最高,而TRAF6基因则在第3天的鸡脾脏、第5天的鸡胸腺和法氏囊中的表达量最高。【结论】鸡TIFA和TRAF6蛋白在禽类中的保守性高,两者在不同月龄鸡和NDV感染鸡的免疫器官中呈不同的表达水平和表达变化趋势,其参与的先天性免疫应答可能在抵抗NDV感染过程中发挥一定作用。

基于深度学习的交通流预测

为进一步完善建设智能交通、促进路网充分利用、缓解交通拥堵并减少CO_(2)排放进而加速实现“碳达峰”,设计并建立一套考虑数据预处理的路网交通流预测模型。模型使用3σ原则对交通流数据进行异常点检测,采用K-means方法对检测到的异常点进行填补,并建立长短时记忆网络对交通流进行预测。以真实案例为样本,采用长短时记忆网络对贵州省某区域路网的交通情况交通流进行预测仿真,实验表明该模型对于具有周期性的交通流预测精度能够达到87.78%。

新城疫病毒M蛋白与宿主蛋白相互作用的研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是单股负链不分节段的RNA病毒,其基因组大小约为15.2 kb,编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白。由于NDV基因组较小,不能编码病毒复制需要的所有蛋白,因此必须借助宿主蛋白来完成NDV的生活周期。M蛋白是一种非糖基化膜相关蛋白,在抑制宿主细胞基因转录、调节病毒基因组复制和转录、促进子代病毒粒子组装和出芽等方面具有重要作用。目前,国内外在M蛋白与NDV毒力和复制的关系,以及以M蛋白为核心的病毒样颗粒形成和利用方面取得了较大的研究进展,但是对M蛋白与宿主蛋白相互作用以及M蛋白如何调控NDV的复制研究进展相对缓慢。鉴于M蛋白在NDV复制中的重要作用,本文主要从M蛋白的结构特征和细胞内定位特征,以及M蛋白与宿主蛋白相互作用的功能研究方面进行综述,以期为更好地认识和研究M蛋白在NDV复制和致病性中的作用提供参考。

鸡TRAF6和TIFA蛋白的序列分析与相互作用验证

旨在对鸡肿瘤坏死因子受体相关因子6 (tumor necrosis factor(TNF) receptor-associated factor 6, TRAF6)和肿瘤坏死因子受体相关因子相互作用的具有叉形头相关结构域蛋白(TNF receptor associated factor (TRAF)-interacting protein with a forkhead-associated(FHA) domain, TIFA)进行序列分析,并进行蛋白质相互作用验证。本研究首先以鸡胚成纤维细胞提取的总RNA反转录产物为模板扩增鸡 TRAF 6和 TIFA 基因的CDS区,分别构建重组真核表达载体pCMV-HA- TRAF 6和pEGFP-C1- TIFA;运用生物信息学软件ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL、MegAlign和PSORTⅡ分别对鸡TRAF6和TIFA蛋白理化性质、二级和三级结构、氨基酸同源性、功能结构域保守性和亚细胞定位进行分析。将重组真核表达载体共转染细胞,通过荧光共定位和免疫共沉淀(Co-IP)试验验证鸡TRAF6和TIFA蛋白之间的相互作用。结果,成功扩增鸡 TRAF 6和 TIFA 基因,并构建其重组真核表达载体pCMV-HA- TRAF 6和pEGFP-C1- TIFA 。序列分析结果显示,鸡 TRAF 6和 TIFA 基因CDS区分别为1 638和564 bp,共编码545和187个氨基酸,分子量约为62 和22 ku。蛋白质二级和三级结构分析结果表明,鸡TRAF6和TIFA蛋白均以无规则卷曲和α螺旋为主。氨基酸同源性分析结果发现,鸡与人和其他哺乳动物TRAF6和TIFA蛋白的同源性分别为76.4%~80.3%和49.7%~53.3%,而与非洲爪蟾的同源性分别为69.4%和49.7%,并且鸡TRAF6和TIFA蛋白的功能结构域存在多个氨基酸位点变异。亚细胞定位预测结果表明,鸡TRAF6和TIFA蛋白主要定位在细胞核。荧光共定位和Co-IP试验结果显示,鸡TRAF6和TIFA蛋白在细胞核中具有共定位,并且存在相互作用。本研究结果显示,鸡与人和其他哺乳动物以及非洲爪蟾TRAF6和 TIFA 蛋白的同源性及功能结构域保守性均较低,但鸡TRAF6和TIFA蛋白能在细胞核中发生相互作用,这可为进一步研究鸡TRAF6和TIFA蛋白相互作用调控鸡相关病毒复制的作用机制奠定基础。

新城疫病毒M蛋白细胞核定位的机制与功能研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)M蛋白一种非糖基化膜相关蛋白,主要位于病毒囊膜内表面,构成了病毒囊膜和核衣壳连接的支架。研究表明,M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白。在NDV感染早期,M蛋白可通过自身携带的核定位信号进入细胞核。根据已报道的相关RNA病毒M蛋白功能的研究结果,推测NDV M蛋白早期的细胞核定位有利于细胞质中病毒基因组的复制和转录,并且可能会抑制细胞基因的转录和蛋白质合成。目前,国内外对M蛋白的研究主要集中在M蛋白与NDV毒力和复制的关系以及以M蛋白为核心的病毒样颗粒形成机制和利用方面,而对M蛋白细胞核定位的机制和功能研究相对较少。鉴于M蛋白细胞核定位在NDV复制和致病过程中的重要作用,本文主要从NDV M蛋白的细胞定位特征、M蛋白细胞核定位的分子机制和功能方面进行阐述,以期为NDV M蛋白细胞核定位的功能及其作用机制研究提供理论参考。

鸡TRAF6和TIFA基因克隆及其组织表达特征分析

【目的】分析肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)及具有叉头相关结构域的TRAF相互作用蛋白(TIFA)基因在贵州黄鸡不同发育阶段各组织中的表达特点,为后续开展TRAF6和TIFA基因调控鸡的生长发育及二者相互作用调控鸡相关病毒复制打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增鸡TRAF6和TIFA基因编码区(CDS)序列,通过ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL及MegAlign等在线软件进行生物信息学分析;同时采用实时荧光定量PCR分别检测TRAF6和TIFA基因在鸡胚发育第14 d(E14d)、鸡出壳第1 d(H1d)、第7 d(H7d)和第14 d(H14d)不同组织中的表达情况。【结果】鸡TRAF6和TIFA基因CDS序列全长分别为1638和564 bp,编码545和187个氨基酸残基,对应的编码蛋白分子量约62和22 kD,理论等电点(p I)为6.14和5.18。鸡TRAF6蛋白二级结构中无规则卷曲占47.08%、α-螺旋占38.14%、延伸链占11.86%、β-转角占2.92%,鸡TIFA蛋白二级结构中无规则卷曲占51.87%、α-螺旋占27.81%、延伸链占16.58%、β-转角占3.74%,二者均以无规则卷曲和α-螺旋为主。TRAF6和TIFA基因核苷酸序列同源比对分析均显示鸡与火鸡的相似性最高,分别为96.4%和92.2%,符合物种进化规律,也表明TRAF6和TIFA基因在禽类中具有一定的遗传保守性。TRAF6和TIFA基因在贵州黄鸡不同发育阶段的眼球、脑组织、心脏、肝脏、肺脏、肌胃、胸肌及腿肌中均有不同程度表达,且内脏组织的相对表达量普遍高于肌肉组织,以肺脏中的相对表达量最高,其次是肝脏和肌胃;从E14d发育到H14d,鸡TRAF6和TIFA基因在肺脏、肝脏和肌胃中的表达均呈先下降后上升的变化趋势,在眼球中则呈先上升后下降再上升的变化趋势,在脑组织、胸肌和腿肌的表达水平较低且趋于稳定。【结论】TRAF6和TIFA基因在鸡不同发育阶段各组织中均有表达,且以肺脏和肝脏中的表达水平相对较高,在脑组织、胸肌和腿肌中的表达相对较低,故推测TRAF6和TIFA基因相互作用对鸡的生长发育具有调控作用。

鸡TRAF6基因外显子区功能性SNP预测与分析

采用生物信息学方法筛选鸡TRAF6基因中的功能性非同义单核苷酸多态性(nsSNPs)位点。从dbSNP数据库中检索出TRAF6基因的8个nsSNPs,利用生物信息学软件PROVEN、SIFT、PhD-SNP和SNAP2分别对nsSNPs进行功能性预测;使用I-Mutant2.0和Mupro对突变位点氨基酸的稳定性进行预测;此外,利用Clustal Omega和Jalview对鸡TRAF6基因编码的氨基酸序列进行多序列比对和进化位点保守性预测。使用MutPred2预测突变可能造成的影响;最后使用Sopma和SWISS-MODEL软件分别预测TRAF6野生型和突变型的蛋白质二级结构和构建它们的三级结构。结果表明:从TRAF6基因的nsSNPs位点筛选出来3个有害突变位点rs736890315(S17R)、rs734934585(C20G)和rs734774178(V472E),其中V472E是四种软件共同筛选出的突变位点。V472E突变位点可能影响鸡TRAF6蛋白的功能,且所有位点突变都会使TRAF6蛋白稳定性降低。保守性分析显示,D16G、S17R和A307T为不保守位点,C20G、S40G、S40R、T42A和V472E为保守的功能性残基;MutPred2预测结果发现,V472E位点的突变导致蛋白质的稳定性改变,其他位点的突变均无显著影响;二级结构分析结果表明,鸡TRAF6蛋白主要以无规则卷曲和α螺旋为主,V472E、S40G和C20G这三个位点上的突变都导致了无规则卷曲百分比的提高和α螺旋百分比下降;三级结构分析结果发现,TRAF6蛋白的野生型和突变体的三级结构与二级结构预测结果一致。本研究预测发现V472E位点突变可能严重影响鸡TRAF6蛋白质的结构,V472E可能是鸡TRAF6基因的潜在功能性位点。

浅议英语教师专业发展的影响因素及对策

教师专业发展是培养和教育教师的过程,贯穿于教师职业生涯全过程的复杂的教育和心理变化过程,是提高专业化事业成长的活动。影响教师专业发展的因素有:教师自身的专业知识能力、成长和专业经历、情感和心理等个人因素;教师继续教育和在职培训缺乏与教师课程实施的衔接,教师知识更新跟不上时代发展要求等。其对策有坚持教学反思、认真理解教材、与学生共同成长等。

鸡SPOP和MyD88基因分子特征及其组织表达特性分析

【目的】掌握SPOP和MyD88基因分子特征及其在鸡不同组织发育过程中的表达特征,为后续研究其调控鸡组织生长发育机理及开展抗病育种提供参考依据。【方法】通过RT-PCR克隆鸡SPOP和MyD88基因编码区(CDS)序列,运用ExPASy、SOPMA、SWISS-MODEL及PSORT II Prediction等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测这2个基因在鸡胚14胚龄(E14 d)及出壳后1 d(H1 d)、7 d(H7 d)和14 d(H14 d)各组织中的表达情况。【结果】鸡SPOP、MyD88基因CDS序列长为1125和900 bp,分别编码374和299个氨基酸残基。SPOP蛋白分子式为C_(1866)H_(2926)N_(496)O_(559)S_(28),相对分子量为42 kD,理论等电点(pI)为5.58,为相对不稳定蛋白;MyD88蛋白分子式为C_(1502)H_(2394)N_(410)O_(438)S_(18),相对分子量为33 kD,pI为5.93,为相对不稳定蛋白。鸡SPOP和MyD88蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,主要定位于细胞质(占60.9%)。与人类和哺乳动物相比,鸡SPOP蛋白的3个功能结构域(MATH、BTB-POZ和BACK)较保守,而MyD88蛋白的2个功能结构域(Death和TIR)存在多处氨基酸位点变异。SPOP和MyD88基因在鸡不同发育阶段各组织中均有表达,但以肺脏中的相对表达量最高,且二者间的表达差异极显著(P<0.01,下同)。从E14 d发育至H14 d,SPOP基因在眼球和肺脏中的表达整体上呈上升趋势,且至H14 d时肺脏中的表达趋于稳定,在脑组织、心脏和肌胃中的表达呈先上升后下降的变化趋势,在肝脏中的表达呈先下降后上升再下降的变化趋势;MyD88基因在眼球、肝脏和肺脏中的表达均呈先上升后下降再上升的变化趋势,在肌胃和胸肌中的表达呈下降趋势,至H14 d时降至最低值。【结论】SPOP和MyD88基因在鸡胚不同发育阶段肺脏、眼球和肌胃中的表达相对较高,SPOP基因的表达水平均极显著高于MyD88基因,且二者的相对表达量呈负相关,即SPOP基因负调控MyD88基因的表达。

鸡BRD2亚细胞定位及其组织表达特性分析

【目的】明确含溴结构域蛋白2(BRD2)的亚细胞定位及其表达特征,为后续研究BRD2基因调控鸡组织发育的作用机制提供参考依据。【方法】通过构建鸡BRD2基因重组真核表达载体pEGFP-BRD2,转染人胚胎肾细胞(HEK-293T)后检测重组蛋白EGFP-BRD2的表达情况及亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR分别检测鸡胚14胚龄(E14 d)、鸡出壳后1日龄(1 d)、7日龄(7 d)和14日龄(14 d)4个时间点各组织中BRD2基因的表达情况。【结果】重组真核表达载体pEGFP-C1-BRD2转染HEK-293T细胞获得的融合蛋白EGFP-BRD2约115.00 kD,且主要定位在细胞核。实时荧光定量PCR检测结果表明,鸡BRD2基因在E14 d和1 d肌胃中的相对表达量最高,在7和14 d肺脏中的相对表达量最高。BRD2基因在各组织的表达规律为:在眼球内E14 d到14 d的表达先下降后趋于稳定;在脑组织和心脏内的表达在E14 d至14 d间呈先下降后上升的变化趋势;在肝脏内E14 d表达稳定,1 d后开始逐渐增加,至14 d时达最高值;在肺脏中E14 d的表达下降,1 d后急剧上升,至14 d时达最高值;在肌胃和胸肌中,均在7 d时最高,1 d时最低,E14 d和14 d时有较高表达,整体上呈倒N表达模式;在腿肌中,从E14 d到1 d表达减少,而后略有增加,7 d后开始下降,至14 d时降到最低值。【结论】鸡BRD2基因重组真核表达载体能在HEK-293T细胞中正确表达,且融合蛋白主要定位在细胞核;BRD2基因在鸡不同发育阶段的各组织中均有表达,但其表达量呈现不同的变化趋势。

鸡TATA结合蛋白的亚细胞定位及基因组织表达特性分析

为探究鸡TATA结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)的亚细胞定位以及TBP基因在鸡胚不同发育阶段不同组织中的表达情况,首先扩增鸡TBP基因的蛋白质编码区(CDS),将其亚克隆至真核表达载体pCMV-Myc构建重组真核表达载体pCMV-Myc-TBP,转染人胚胎肾细胞(HEK-293T),然后利用蛋白质印迹法和间接免疫荧光法分别检测重组蛋白的表达和亚细胞定位;进一步通过RT-qPCR方法检测TBP基因在鸡胚胎期14 d(E14 d)、出壳后1日龄(1 d)、7日龄(7 d)和14日龄(14 d)4个时间点各组织中的表达情况。结果表明,成功构建了鸡TBP基因的重组真核表达载体pCMV-Myc-TBP,转染细胞后获得与预期大小一致的Myc-TBP重组蛋白条带。亚细胞定位分析结果显示,鸡TBP蛋白主要定位在细胞核。RT-qPCR检测结果显示,鸡TBP基因在E14 d到14 d的各组织中均有表达,但均以肺脏中的表达量高,其中在1 d鸡的肺脏中表达量最高。对鸡TBP基因组织表达变化趋势分析发现,在E14 d至14 d,TBP基因在眼球、脑、心脏、肝脏、肌胃、胸肌、腿肌中的表达整体呈下降趋势,没有明显的变化规律;而肺脏中的TBP基因表达水平先升高后降低再升高,整体呈"N"型变化趋势。本研究证实鸡TBP蛋白主要定位在细胞核,TBP基因在鸡胚发育不同阶段的各组织中都有表达,但以肺脏中的表达量高。

鸡干扰素调节因子7的分子特征及其组织表达特性分析

【目的】明确鸡干扰素调节因子7(chIRF7)的分子特征及chIRF7基因在不同发育阶段各组织中的表达特点,为后续开展IRF7基因调控鸡相关组织发育和抗病毒研究打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增chIRF7基因编码区(CDS)并构建其重组真核表达载体,通过SOPMA、SWISS-MODEL及BioEdit等在线软件预测分析chIRF7蛋白的二、三级结构及结构域保守性;以重组真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞系(DF-1),观察融合蛋白的亚细胞定位情况及分析过表达融合蛋白对新城疫病毒(NDV)复制的影响;采用实时荧光定量PCR检测chIRF7基因在鸡胚发育第14 d(E14d)及鸡出壳第1 d(H1d)、第7 d(H7d)和第14 d(H14d)不同组织中的表达情况。【结果】将从鸡外周血淋巴细胞中扩增获得的chIRF7基因CDS序列插入真核表达载体pEGFP-C1的酶切位点即成功构建获得重组真核表达载体pEGFP-chIRF7。chIRF7蛋白二级结构由无规则卷曲(占51.12%)、α-螺旋(占26.48%)、延伸链(占16.70%)和β-转角(占5.70%)组成;鸡与其他禽类、人类和哺乳动物的IRF7氨基酸序列相似性均较低,且5个功能结构域不保守。经聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]或NDV处理DF-1细胞后,可使融合蛋白EGFP-chIRF7由细胞质定位转变为细胞核定位;而在细胞内过表达融合蛋白EGFP-chIRF7可降低NDV的复制能力和细胞致病性。chIRF7基因在鸡不同发育阶段各组织中均有不同程度的表达,且以肺脏中的相对表达量最高,其次是肝脏和腺胃,在腿肌中的相对表达量较低;从E14d发育到H14d,chIRF7基因在肺脏中的表达呈先下降后趋于稳定的变化趋势,在肝脏、腺胃、心脏和腿肌中呈先下降后上升再下降的变化趋势,在脑组织中呈先稳定再下降的变化趋势,在胸肌和眼球中的表达则趋于稳定。【结论】IRF7在不同物种中的相似性较低且结构域不保守,经外界刺激诱导表达的chIRF7会发生细胞核移位而具有抗病毒感染效果。IRF7基因在鸡不同发育阶段的肺脏、肝脏和腺胃中高表达,说明对这3个组织的发育可能具有调控作用。

鸡BRD2基因及其剪接体的克隆测序与亚细胞定位分析

【目的】克隆鸡含溴结构域蛋白2(BRD2)基因及其剪接体,并对其进行序列分析和亚细胞定位,为深入研究鸡BRD2基因及其剪接体在细胞转录调控中的作用机理打下基础。【方法】通过RT-PCR扩增鸡BRD2基因及其剪接体的编码区(CDS)序列,采用BioEdit、ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL、CDART等在线软件进行生物信息学分析;鸡BRD2基因及其剪接体经Xho I和Bam H I双酶切后,分别亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1多克隆位点上构建重组真核表达载体,通过转染HEK-293T细胞进行亚细胞定位分析。【结果】鸡BRD2基因CDS序列全长2340 bp,编码779个氨基酸残基,分子量为85.66 k D,理论等电点(pI)为8.74,其编码蛋白二级结构主要由无规则卷曲(60.59%)和α-螺旋(28.50%)组成,含有3个明显的功能结构域(2个BD结构域和1个ET结构域)。与鸡BRD2基因相比,其剪接体BRD2-X1、BRD2-X2和BRD2-X3的CDS序列长分别为2301、2283和1983 bp,编码766、760和660个氨基酸残基。以鸡BRD2氨基酸序列为参照,BRD2-X1表现为第526~537位氨基酸缺失,BRD2-X2表现为第1~19位氨基酸缺失,BRD2-X3表现为第1~119位氨基酸缺失;与鸡BRD2蛋白相比,鸡BRD2基因剪接体BRD2-X1和BRD2-X2并未影响鸡BRD2蛋白的功能结构域,而剪接体BRD2-X3导致鸡BRD2蛋白第一个BD结构域部分缺失。鸡BRD2基因融合蛋白EGFP-BRD2及其剪接体融合蛋白EGFP-BRD2-X1、EGFP-BRD2-X2和EGFP-BRD2-X3均定位在细胞核,EGFP-BRD2和EGFPBRD2-X1在细胞核中呈均匀分布,而EGFP-BRD2-X2和EGFP-BRD2-X3在细胞核中呈不均匀的点状分布。【结论】鸡BRD2蛋白及其剪接体均定位在细胞核,但BD结构域缺失可引起BRD2剪接体BRD2-X3细胞核定位模式的变化。

鸡ANP32家族蛋白亚细胞定位及其在免疫器官中的表达特征分析

【目的】明确鸡ANP32家族蛋白的亚细胞定位及在不同月龄鸡免疫器官中的表达特征,为后续研究鸡ANP32家族蛋白与新城疫病毒(NDV)复制及其致病性的关系打下基础。【方法】分别构建鸡ANP32家族基因重组真核表达载体,转染HEK-293T细胞后进行诱导表达,利用Western blotting检测融合蛋白表达情况,并通过荧光观察分析融合蛋白亚细胞定位;同时采用实时荧光定量PCR检测ANP32家族基因在1~6月龄鸡免疫器官(脾脏、胸腺和法氏囊)中的表达水平。【结果】成功构建了鸡ANP32家族基因重组真核表达载体pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E,转染HEK-293T细胞后得到正确表达,获得携带EGFP标签的融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFPANP32B和EGFP-ANP32E,其分子量分别为60.0、57.9和56.9 k D。亚细胞定位分析结果表明,融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E的荧光与细胞核荧光完全重合,即主要定位在细胞核。实时荧光定量PCR检测结果表明,ANP32家族基因在1~6月龄鸡免疫器官(脾脏、胸腺和法氏囊)中均有表达,且在不同免疫器官中的表达水平存在差异;ANP32A和ANP32E基因在1~6月龄鸡免疫器官中呈先上升后下降的表达趋势,且在2月龄免疫器官中的相对表达量达峰值;ANP32B基因的表达则呈下降趋势,以1月龄鸡免疫器官中的相对表达量最高。【结论】鸡ANP32家族蛋白主要定位于细胞核,且ANP32家族基因在不同月龄鸡免疫器官中均有表达,但这3个基因具有独特的表达特征,其表达差异与免疫器官发育及免疫功能间的关系有待进一步探究。

鸡卵泡膜细胞中膜联蛋白A2互作细胞蛋白的筛选及其功能分析

【目的】从鸡卵泡膜细胞蛋白中筛选和鉴定与膜联蛋白A2(ANXA2)相互作用的细胞蛋白并进行功能分析,为深入研究ANXA2调控鸡卵泡发育的作用机制提供理论依据。【方法】制备开产后30周龄贵州黄鸡的卵泡膜细胞,提取卵泡膜总蛋白后利用His Pull-Down联合质谱技术(LC-MS/MS)从卵泡膜细胞中筛选出与鸡ANXA2互作的细胞蛋白,然后通过GO数据库和KEEG数据库分别进行GO功能富集分析及KEEG信号通路注释分析,并利用STRING Version 11.0绘制蛋白互作网络图。【结果】通过His Pull-Down联合LC-MS/MS共鉴定获得41个鸡ANXA2互作细胞蛋白,GO功能富集分析发现这些互作细胞蛋白在分子功能、生物学进程和细胞组成均发挥作用。其中,在分子功能方面主要涉及蛋白结合(占58.06%)、催化活性(占19.35%)、核糖体结构(占16.13%)及细胞骨架结构组成(占6.45%),在生物学进程方面主要参与细胞骨架(占19.35%)、刺激反应(占19.35%)、翻译(占16.13%)、代谢过程(占12.90%)、细胞迁移(占12.90%)、蛋白折叠(占9.68%)和蛋白运输(占9.68%),而细胞组分显示以定位于细胞膜的蛋白为主(占32.26%)。鸡ANXA2蛋白互作细胞蛋白参与的KEEG信号通路主要有应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫系统和蛋白定位等。鸡ANXA2互作细胞蛋白互作网络可分为3条,即CNN2-FN1-MYH9-MYH10-ACTN1-CSRP1、ANXA1-ANXA2-ENO1-PRDX4-GPI-ATP5B-PRDX3-HSPA8-TUBB2A和CCT7-CCT4-GNB2L1-ATP5A1-RPS3-RPS3A-RPL23A-RPL22-RPS7;互作细胞蛋白间存在复杂的互作关系,其中又以膜联蛋白A1(ANXA1)与烯醇化酶-1(ENO1)及ANXA2的互作关系最明显。【结论】鸡ANXA2互作细胞蛋白主要参与细胞骨架形成、应对刺激和翻译等生物学过程,涉及应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫及蛋白定位等信号通路。其中,PRDX3、PRDX4、MYH9和TCSC可能通过与ANXA2蛋白相互作用而参与鸡卵巢相关疾病的发生,而ANXA1与ANXA2相互作用可能在鸡卵泡的发育及排卵过程中发挥重要调节作用。