梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd基因的克隆、表达及其免疫活性研究

利用PCR技术从Tp Nichols株基因组模板中扩增梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)外膜蛋白Gpd基因,定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd,免疫印迹和免疫组化技术检测pcDNA3.1(+)-Gpd在HeLa细胞中的表达;同时将真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd免疫新西兰兔,检测其在兔体内的免疫应答效果。免疫印迹和免疫组化鉴定均显示重组体在HeLa细胞中能有效表达一个41kD的Gpd融合蛋白。新西兰兔接种核酸疫苗后,能产生特异性抗体,第3次免疫后2周抗体最高滴度可达1∶1024,免疫后兔脾细胞受Gpd蛋白刺激有明显增殖反应。所诱导的抗体水平和脾淋巴细胞增殖情况均显著高于空质粒对照组和空白对照组(p<0.05)。Tp真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd的成功构建及能刺激新西兰兔产生较强特异的免疫应答,为Gpd蛋白生物学功能及梅毒DNA疫苗的深入研究奠定了一定的实验基础。

梅毒螺旋体膜蛋白Tp92真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的 以梅毒螺旋体 (Treponemapallidum ,Tp)外膜蛋白基因Tp92为目的基因 ,构建Tp真核表达重组体pcDNA3 .1(+ ) -Tp92 ,并鉴定其在Hela细胞能否正确表达 ,为进一步开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。 方法 应用PCR技术从TpNichols株基因组模板中扩增Tp92基因 ,定向克隆构建真核表达重组体 pcDNA3 .1(+ ) -Tp92 ,脂质体介导将 pcDNA3 .1(+ ) -Tp92转染入Hela细胞 ,以免疫酶标法和一步法RT -PCR检测pcDNA3 .1(+ ) -Tp92在Hela细胞中的表达情况。 结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建Tp真核表达重组体pcDNA3 .1(+ ) -Tp92 ,DNA测序显示重组质粒含有 2 10 3bp的目的基因片段 ,读码框架正确 ,无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较 ,载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Tp92基因序列完全一致 ,同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为 95 .5 %～ 10 0 % ,证实本研究所得到的基因为所需基因 ,同时也表明该基因为Tp的保守性基因。免疫酶标法结果显示该重组体在Hela细胞能有效表达目的蛋白与梅毒阳性标准血清中相应抗体反应 ;RT -PCR检测结果显示RT -PCR扩增产物与Tp92基因片段大小相符 ,确实源于重组质粒转录后的mRNA。

浅谈现代科技革命对病原生物学研究的影响和推动

分子生物学、免疫学、细胞生物学等基础学科的发展,使病原生物学各病原体的研究已不仅仅停留在器官、细胞水平,而是深入到蛋白质、基因水平,这也极大地推动了病原生物学在诊断、治疗、致病机制、预防和流行病学方面研究的扩展与深入。

梅毒螺旋体Gpd-IL-2融合基因原核表达重组体的构建、表达及免疫活性的初步研究

目的以梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白基因Gpd及细胞因子佐剂IL-2为目的基因,融合构建原核表达重组体pET28a/Gpd-IL-2,表达鉴定并进行免疫活性的初步分析,为进一步开展Tp疫苗动物实验打下基础。方法定向克隆构建原核表达重组体pET28a/Gpd-IL-2进行诱导表达;Ni亲和层析纯化重组融合蛋白后,Western blot检测其免疫反应性;免疫新西兰兔评价重组蛋白的免疫原性。结果成功构建原核表达重组体pET28a/Gpd-IL-2,表达鉴定及纯化获得相对分子量约为60 kDa的融合蛋白;Western blot检测其能与梅毒阳性血清发生特异性结合,说明两融合基因之间的表达相互没受到太大影响;纯化的Gpd-IL-2重组蛋白免疫新西兰兔能诱导其产生特异性免疫应答,ELISA检测免疫血清中特异性抗体滴度在1∶6 400以上。结论 Gpd-IL-2融合基因重组蛋白具有良好的免疫活性,这为进一步开展Tp疫苗动物实验条件的优化打下一定的基础。

虚拟仿真实验在医学微生物学实验教学中的应用体会

虚拟仿真实验教学是高等教育信息化建设的重要内容。虚拟仿真实验在医学微生物学实验教学中发挥重要作用,不仅可拓展由于实验室生物安全、经费和场地设施紧张等问题而不能开设的实验项目,开阔知识领域,而且可以强化学生实验基本技能和激发学生求知欲,对于培养学生的科学精神和创造性思维,提高专业技能均具有重要意义。

粤北地区铜绿假单胞菌的临床分布和耐药性特点

目的分析粤北地区临床分离的铜绿假单胞菌株分布特点和对常用抗菌药物的耐药特点,为临床合理选用抗菌药物治疗、预防感染及防止耐药菌株的产生提供参考依据。方法按常规方法从粤北地区临床标本中分离培养铜绿假单胞菌,应用WHONET5.6和SPSS19.0统计软件分析2013-2014年的药敏试验数据,分析铜绿假单胞菌的耐药特点。结果 584株铜绿假单胞菌感染主要来自于重症医学科、骨科和呼吸内科,以呼吸道标本和伤口分泌物标本为主;铜绿假单胞菌对药敏试验的12种抗菌药物具有不同程度的耐药性,其中耐药率最高的是庆大霉素,对喹诺酮类、碳青霉烯类、加酶抑制剂类耐药率相对较低,头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星和头孢哌酮/舒巴坦的耐药性呈下降趋势。结论铜绿假单胞菌主要引起肺部和伤口感染,尤其在重症医学科、骨科和呼吸内科的老年患者多见;该菌对临床常用抗菌药物的耐药率相对较低,但临床仍需规范使用抗菌药物,以减少耐药菌株、尤其是多重耐药株和泛耐药株的产生。

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0663前炎症活性的研究

目的探讨梅毒螺旋体(Tp)重组Tp0663蛋白(rTp0663)潜在的前炎症活性并初步探讨可能参与激活的信号分子,为阐明Tp的致病机制提供依据。方法体外以不同剂量rTp0663以不同时间刺激THP-1细胞源性人巨噬细胞,ELISA分别检测其产生前炎症细胞因子IL-1β和IL-6的水平;以rTp0663刺激经抗TLR2、抗CD14、抗TLR2与抗CD14联合、NF-κB特异性抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)处理后的巨噬细胞,检测其释放IL-1β和IL-6的水平。结果 rTp0663在一定范围内内以剂量和时间依赖方式显著诱导巨噬细胞产生IL-1β和IL-6,在3μg/mL刺激剂量和刺激24 h时达到高峰;Tp0663刺激经抗TLR2、抗CD14、抗TLR2与抗CD14联合、PDTC预处理后的巨噬细胞释放IL-1β水平分别下降至63.0%、69.0%、51.3%和15.8%,IL-6分别降至66.0%、71.0%、54.3%和18.7%。结论 rTp0663可通过TLR2和CD14激活NF-κB诱导THP-1源性人巨噬细胞产生前炎症细胞因子,Tp0663可能是Tp的一个重要的致病因子。

梅毒螺旋体Tp0453重组蛋白的表达纯化及免疫活性研究

目的表达梅毒螺旋体膜蛋白Tp0453(28-288 aa),纯化表达产物并进行免疫活性分析,为探索Tp0453重组蛋白在梅毒血清学诊断中的应用提供实验依据。方法通过生物信息学分析,挑选Tp0453抗原的优势表位,进行诱导表达;以W estern-b lot和间接ELISA法检测重组蛋白的免疫反应性;用重组蛋白免疫新西兰家兔,评价其免疫原性。结果纯化后获得了相对分子量约为32×103的融合蛋白。W estern-b lot检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;同时以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法,检测梅毒诊断试剂参考血清,其阴阳性符合率均为100%。用纯化的Tp0453重组蛋白免疫新西兰家兔,能诱导其产生特异性免疫应答,ELISA法测定免疫血清中特异性抗体滴度在1∶1280以上。结论基因重组表达的Tp0453重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用和其生物学功能奠定了基础。

梅毒实验室检测方法的研究进展

梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种严重危害人类健康的性传播疾病,选择敏感性高、特异性强的检测方法对于梅毒的确证和临床指导应用均具有很重要的意义。当前,有多种梅毒实验室检测方法,其中直接检测法在近十年的临床诊断中仍被经常使用,血清学检测法仍然是目前梅毒实验室诊断的主要方法,以各类PCR技术为代表的梅毒分子生物学检测方法因其具有高度的特异性和敏感性已被广泛应用于临床检验。对梅毒实验室检测技术中直接法、血清学检测法及PCR检测法三类方法的研究进展进行了综述。

抗梅毒螺旋体重组蛋白Tp0453单克隆抗体的制备及应用研究

目的利用基因重组抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0453的单克隆抗体(mAb),评价其在早期梅毒Tp抗原诊断中的应用。方法以重组蛋白Tp0453免疫BALB/c小鼠,将免疫后的小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,用间接ELISA和Western Blot检测杂交瘤细胞分泌的抗体,并对阳性细胞经亚克隆建株;体内诱生腹水法制备抗体,用硫酸铵沉淀法对mAb进行纯化并测定其亚类和效价;以自制的mAb建立间接免疫荧光法(IIF)检测梅毒患者分泌物标本,并与镀银染色的检测结果进行比较。结果获得4株稳定分泌抗重组蛋白Tp0453的杂交瘤细胞株,分别命名为15B2、8B9、9C6和2F8,其mAb效价分别为1∶25000、1∶8000、1∶50000、1∶10000;2F8杂交瘤细胞分泌的mAb为IgG2b,其他3株交瘤细胞分泌的mAb均为IgG1;4株mAb腹水经SDS-PAGE均显示出一条分子量约为50kDa的重链条带和一条分子量为26kDa的轻链条带;4株杂交瘤细胞染色体数在90～108范围内变化。IIF显示自制的mAb能与天然的Tp抗原结合,检测86例分泌物标本,IIF与镀银染色的符合率为95.3%。结论本实验成功获得了抗Tp0453重组蛋白的mAb,该mAb能识别天然的Tp0453抗原,有望应用于早期梅毒感染的抗原检测。

梅毒的实验室诊断方法及其应用进展

梅毒发病周期长,临床表现复杂,漏诊或误诊率较高,目前尚无对各期梅毒都有高敏感性和特异性的检测方法。本文通过综述梅毒螺旋体显微镜检、梅毒螺旋体非特异性抗体试验、梅毒螺旋体特异性抗体试验及聚合酶链反应技术在各期梅毒检测中的研究及应用进展,为临床医生提供参考意见。对于怀疑一期梅毒但血清学梅毒螺旋体特异性抗体试验检测阴性者,应取分泌物进行病原学检测,或选用聚合酶链反应技术进一步检测,或建议患者定期复查。对于二期、三期及隐性梅毒患者,应首选血清学梅毒螺旋体特异性抗体试验检测。

衡阳地区淋球菌流行株对抗生素耐药性监测

目的 了解衡阳地区淋球菌流行株对抗生素的耐药性及产青霉素酶淋球菌(PPNG)和高水平耐四环素淋球菌(TRNG)的流行状况。 方法 采用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)以及用改良碘法检测β-内酰胺酶。 结果 10 1株淋球菌共检出PPNG 3 2株(3 1.7% )、TRNG 2 0株(19.8% ) ,对四环素、环丙沙星、青霉素及大观霉素的耐药率分别为94.1%、91.1%、89.1%和2 .0 % ,未发现耐头孢曲松钠的菌株。淋球菌交叉耐药情况较为严重,79.2 %菌株对青霉素和环丙沙星呈现交叉耐药,84.2 %菌株对四环素和环丙沙星呈现交叉耐药。 结论 头孢曲松钠和大观霉素仍可作为衡阳地区淋病治疗的首选药物,但大观霉素已出现耐药株,应引起临床医师的高度警惕;

基于虚拟环境下的医学微生物学实验教学模式研究

实验教学是医学微生物学教学的重要组成部分,将虚拟实验引入医学微生物学实验教学,不仅可以拓展实践教学内容,强化实验操作技能,而且可以充分调动学生的学习积极性,有效提高学生的科研思维和创新能力。构建医学微生物学虚拟实验教学模式,应建立以学生为主体的实验设计思路,加大医学微生物学虚拟实验教学资源建设,加强虚拟教学团队建设,完善保障和激励机制,这样才能不断推动实验教学的改革与创新,培养创新性医学人才。

梅毒螺旋体致病相关蛋白的研究进展

苍白密螺旋体苍白亚种（Treponema．pallidumsubsp．pallidum，Tp）俗称梅毒螺旋体，是人类性传播疾病（STD）梅毒（syphilis）的病原体。梅毒是一种严重危害人类健康的性传染性疾病，其不仅严重损害人体的多个器官从而引起全身性损害，还可由母体经胎盘垂直传播给胎儿，引起早产、流产、

逆向案例教学法在医学微生物学教学中的应用

针对医学微生物学与临床医学的紧密联系性,以白喉棒状杆菌为例,介绍逆向案例教学法在医学微生物学教学中的内涵和实施步骤,总结逆向案例教学法与传统教学法相比所具有的优势和实施过程中应注意的问题,以便探讨其在医学微生物学教学中应用的可行性。

病原生物学数字化多元教学模式的构建

在"以培养学生创新精神和能力为目标,理论与实践相结合、网络和课堂相结合、现代与传统相结合、课内和课外相结合"的理念指导下,构建数字化平台下的多元化教学模式,旨在提高学生的学习能力、创新精神和实践能力。该教学模式以教学应用为核心,融合现代多媒体教学手段和传统教学方法,实现教学场所、教学设备、教学内容、教学方法、教学手段的有效整合,形成课堂内外共同组成的、面向全体学生的、多角度、多层面的教学平台;并建立以课程组为中心、协调课堂内外学生学习环节的运作机制,更好地服务于学生,切实促进医学创新型人才的培养。

医学微生物学教学改革初探

为适应现代化教育模式的转变,推进高校教育改革事业的发展,文章针对医学微生物学课程的特点及教学过程中的问题,结合南华大学对微生物学教学改革的实践,提出了一些教学经验。实践证明:PBL案例教学、多媒体教学、网络自主教学、启发式教学、读书报告式教学等教学方法能充分激发学生的学习兴趣,发挥学生的主体性,培养学生的思维能力,达到了很好的教学效果。

网络新媒体交流模式下的基础医学硕士研究生科研能力培养

基础医学硕士研究生是我国医学科学研究团队的生力军和后备力量。如何顺应新时代基础医学的发展需求,改进改良高等院校传统的医学硕士研究生培养模式、方法及手段,进一步加强基础医学硕士研究生科研能力的培养,一直是21世纪中国高等基础医学教育领域关注和改革的重点及难点。随着网络新媒体技术的迅速发展,将研究生课程学习设置到复杂的、有意义的科学问题情景之中的PBL教学模式,结合流媒体、云储存技术以及微信/QQ等网络新媒体技术,将更符合基础医学硕士研究生的新时代科研思维培养规律,在提高研究生科研思维、独立创新能力以及自主学习能力等科研能力培养方面凸显优势。

梅毒螺旋体纤连蛋白结合蛋白Tp0136前炎症活性的研究

目的初步研究梅毒螺旋体纤连蛋白结合蛋白Tp0136潜在的前炎症活性。方法构建重组质粒p ET-28a/Tp0136并诱导其表达目的蛋白;将不同浓度(1、2、5、10μg/m L)的r Tp0136分别刺激THP-1源性巨噬细胞,ELISA法分别检测其产生前炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平;并同时用二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预先处理巨噬细胞,检测相应细胞因子分泌量。结果成功构建了p ET-28a/Tp0136重组质粒,并诱导表达和纯化出r Tp0136;重组蛋白能诱导巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α,并且呈浓度和时间依赖性;重组蛋白刺激经PDTC预处理后的巨噬细胞,其IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平分别降至32%、35%和27%。结论r Tp0136可诱导巨噬细胞产生前炎症细胞因子,该过程可能受NF-κB调控。

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0608的表达与鉴定

目的表达梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0608(rTp0608)并鉴定其抗原性,为深入探讨其在梅毒血清学诊断中的价值奠定基础。方法 PCR扩增Tp0608全长基因,构建原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608,转化宿主菌诱导表达rTp0608,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE分析蛋白表达形式与纯度,Western blot鉴定rTp0608的抗原性。结果原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608在宿主菌内经诱导表达了分子量大约为38 kDa的重组蛋白,以包涵体表达形式为主,纯化蛋白的纯度>95%;Western blot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者混合血清特异性识别。结论 PET-28a(+)表达载体高效表达了rTp0608,该重组抗原有良好的抗原性。