不同的冻存方法对1型糖尿病患者胰岛抗原特异性T细胞反应的影响

目的:明确何种冻存方案更利于保持1型糖尿病患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells,PBMCs)对胰岛抗原特异性的T细胞反应,更接近于新鲜细胞的状态。方法:本研究系国际免疫学协会-T细胞工作组(IDS-TCW)牵头的国际标准化研究Freezing Study I。中南大学糖尿病中心选取5例新发的T1D患者和年龄、性别相匹配的5例正常对照。所有对象新鲜分离的PBMCs分为3份,一份进行亚型细胞的流式细胞分析和酶联免疫斑点实验(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT),另两等份分别采用低温和室温冻存方案冻存;1个月后分别按低温和室温方案复苏,以台盼蓝染色判定细胞活力;并行流式细胞分析术和ELISPOT检测。ELISPOT中4种抗原[包括人GAD65、内对照、Pediacel(巴斯德五合一疫苗)和PMA]均由IDS-TCW中心化实验室盲法标记,盲法测定。以新鲜PBMCs为参照,比较两种冻存方案下PBMCs的复苏率和活力、各亚型细胞比例和ELISPOT检测结果。结果:1)室温冻存下的PBMCs复苏率和细胞活力均略高于低温冻存方案,但二者差异无统计学意义(分别为61.2%vs 60.1%,77.5%vs 74.9%;P>0.05);2)相比新鲜细胞,两种冻存方案均会造成一定程度的单核细胞的损失[(3.2±1.1)%(低温)和(3.0±0.9)%(室温)vs(7.0±1.1)%(新鲜);P<0.05];而CD4+T,CD8+T,B细胞,NK细胞和NKT细胞比例均无明显变化(P>0.05);3)ELISPOT检测结果显示:对多克隆刺激物PMA诱发的T细胞分泌IFN-γ的反应,在新鲜和冻存复苏细胞间无明显差异;记忆性抗原Pediacel和胰岛抗原GAD65刺激下的特异性T细胞反应在冻存复苏细胞均明显差于新鲜细胞,T1D患者新鲜细胞的GAD特异性T细胞反应的SI为5.1,均高于低温(1.3)和室温(1.4)冻存复苏的刺激指数(SI)(均P<0.05);而且仅新鲜细胞的GAD-反应性T细胞的SI和斑点数均明显高于正常对照(5.1 vs 0.9和8.1 vs 0.1,P<0.05),而两种方案下的冻存细胞的SI在患者和对照未发现差异。结论:需要开展更多的研究,在T1D患者中鉴定出一种更接近于新鲜PBMCs反应的冻存方案和T细胞测定方法。

IL-2和IL-7对优化检测1型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶65特异性T细胞反应的比较

目的:探讨何种细胞因子(IL-2或IL-7)及其最佳浓度能够最有效地改善酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot,ELISPOT)检测1型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65)特异性T细胞反应的效率。方法:选取20例1型糖尿病患者(A组)及年龄和性别均匹配的16例正常对照者(B组);Ficoll法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),以人GAD65、内对照、巴斯德五合一疫苗为抗原,加入不同浓度的IL-2[0 U/m L(1组)、0.5 U/m L(2组)、2.5 U/m L(3组)和12.5 U/m L(4组)],ELISPOT检测上述各浓度组分泌干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)的CD4+T细胞,比较各浓度组的GAD65孔(信号)、内对照孔(背景)的斑点数、斑点净值以及刺激指数(即信噪比,stimulating index,SI);另选取21例1型糖尿病患者(C组)及12例正常对照者(D组),检测针对GAD65抗原的特异性T细胞反应,比较联合IL-2(2.5 U/m L,上述实验已证明其为最优浓度,5组)与联合IL-7(0.5 ng/m L,6组)所产的斑点数和SI。结果:1)A组在加入IL-2刺激后,各浓度组中GAD65反应性T细胞数均较A1组增高,而各浓度下的内对照孔的斑点数亦呈比例升高。各浓度组斑点净值比较显示:A4组与A3组差异无统计学意义(P>0.05),而SI的比较则提示A3组最高;且仅A3组的SI(2.8)高于B3组(1.5),差异有统计学意义(P<0.05)。2)C6组及D6组的GAD65孔斑点数均分别略高于C5组及D5组,且C6组及D6组的斑点数增幅也分别高于C5组及D5组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。C5组的斑点净值(5.5)和SI(2.8)均显著高于C6组的斑点净值(4.3)和SI(1.8),差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:2.5 U/m L为ELISPOT检测1型糖尿病患者GAD65特异性T细胞反应的IL-2最佳浓度;IL-2较IL-7更有利于改善ELISPOT检测的SI。

恩格列净对非肥胖成人1型糖尿病患者血糖波动的影响:一项随机平行对照试验

目的探讨恩格列净联合胰岛素治疗对非肥胖成人1型糖尿病(T1DM)患者血糖波动的作用。方法本研究为前瞻性、随机对照、开放标签的临床研究。纳入2019年11月至2022年12月在中南大学湘雅二医院就诊的60例T1DM患者,按照SPSS 26.0软件生成的随机数将受试者以1∶1的比例随机分配,分别接受恩格列净联合胰岛素治疗(干预组)或胰岛素治疗(对照组)6个月,每组30例患者。主要结局指标为血糖波动情况,通过平均血糖波动幅度(MAGE)、血糖水平标准差(SD)和变异系数(CV)来评估血糖波动。次要结局指标为血糖控制情况,通过有效降糖率、糖化血红蛋白(HbA_(1c))水平、HbA_(1c)达标率、胰岛素日剂量、葡萄糖高于/低于/在目标范围内时间、血糖风险指数来评估血糖控制情况。通过低血糖事件和不良事件发生率评估安全性。HbA_(1c)降低>0.3%视为有效降糖。组间比较采用混合效应模型和广义估计方程,组内比较采用配对t检验。结果共有59例T1DM患者纳入分析,其中干预组29例,对照组30例,两组性别差异无统计学意义[男性占比分别为58.62%(17/29)和36.67%(11/30),P=0.091]。结果显示,干预组评估血糖波动指标与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。干预组有效降糖率显著高于对照组[分别为61.54%(16/26)和28.00%(7/25),P=0.016]。安全性分析显示,两组患者低血糖的发生率差异无统计学意义[分别为85.71%(24/28)和81.48%(22/27),P=0.729];试验期间两组均未发生酮症酸中毒事件。结论恩格列净联合胰岛素治疗非肥胖T1DM患者的安全性良好,未明显增加低血糖和酮症酸中毒风险,可改善非肥胖成人T1DM患者的血糖控制,尚未观察到对血糖波动的有益作用。

胰岛素抵抗对1型糖尿病患者颈动脉内膜中层厚度影响的研究

目的探讨IR对T1DM患者颈动脉内膜中层厚度(CIMT)的影响。方法选取2020年7月至2022年2月于中南大学湘雅二医院代谢内分泌科治疗的T1DM患者179例。采用估计葡萄糖处理率(eGDR)评估IR,按eGDR中位数进行分组,以eGDR<10.0 mg/(kg·min)定义为高IR状态。由超声科医生测量CIMT,CIMT≥0.9 mm或有斑块定义为CIMT异常。结果179例T1DM患者平均eGDR为10.0(8.9,10.7)mg/(kg·min),CIMT异常率为14.5%。CIMT异常比例与年龄和IR相关,在年龄>30岁(33.3%vs 1.0%)和高IR状态患者(20.7%vs 8.0%),CIMT异常比例高(P<0.05)。二元Logistic回归分析显示,IR是CIMT异常的危险因素。结论T1DM患者IR程度与CIMT异常密切相关;在年龄>30岁的患者中,IR是CIMT异常的危险因素。

第四届湘雅国际糖尿病免疫学论坛会议纪要

由中南大学糖尿病中心、《中国糖尿病杂志》社及《糖尿病天地》杂志社共同主办的“第四届湘雅国际糖尿病免疫学论坛”已于2009年4月23～25日在湖南长沙举行。本届论坛是在前三届成功举办的基础上再次召开的糖尿病免疫学专题研讨会，会议的主题为“免疫与代谢网络：探索糖尿病发病与干预的新途径”。会议邀请了美国ADA2008Banting奖得主RalphDeFronzo教授，国际糖尿病免痰学会秘书长、瑞典Karolinska学院CaraniSanJeevi教授，EASD2008新星奖得主、法国INSERM国际T细胞委员会主席RobertMal—lone教授.

1α，25一二羟维生素D3对胰岛β细胞的保护作用及其机制探讨

目的观察1α，25一二羟维生素D3（简称VitD3）抑制白介素1B（IL-1β）和干扰素y（IFN-y）诱导胰岛β细胞凋亡的作用及对胰岛素分泌功能的影响，探讨其可能的作用机制。方法将VitD3和IL-y／IFN-y作用于细胞后，采用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞的生长增殖率、赫斯特荧光染色观察细胞凋亡形态变化、磷脂结合蛋白v／碘化丙啶双染色流式检测细胞凋亡率、酶联免疫分析检测葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）。结果IL-1β／IFN-y组细胞生长增殖率为32．O％±2．7％，不同浓度VitD3（10-10、10-9、10-8mol／L）＋IL-β／IFN-1β/IFN-Y组细胞生长增殖率分别为54．0％±3．2％、59．0％±1．5％，73．0％±2．1％，与IL-β／IFN-1组比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）；

暴发性1型糖尿病临床流行病学调查

目的了解住院糖尿病患者中暴发性1型糖尿病的患病状况。方法采用Hanafusa提出的标准诊断暴发性1型糖尿病。系统性回顾2001～2008年本院内分泌科住院糖尿病患者情况,分析暴发性1型糖尿病所占比例。结果 8年间本院内分泌科住院糖尿病患者共8801例,其中新诊断急性起病1型糖尿病患者107例,暴发性1型糖尿病患者为11例。暴发性1型糖尿病约占本院连续住院糖尿病患者的1‰,新发1型糖尿病患者的10%。未观察到暴发性1型糖尿病发病逐年增加及月份聚集现象。结论暴发性1型糖尿病呈散发,成年人中常见,临床中应注意鉴别诊断。

CTLA-4＋49A／G和CT60基因多态性与1型糖尿病合并甲状腺自身免疫的相关性

目的探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）＋49A／G和CT60基因多态性与1型糖尿病（T1DM）合并甲状腺自身免疫的关系。方法对332例T1DM，476名健康对照进行CTLA-4基因多态性及甲状腺自身抗体检测。CTLA-4＋49A／G、CT60基因型采用限制性片段长度多态性检测，甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、甲状腺球蛋白抗体（TGAb）采用放射免疫法检测，谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体（IA-2A）采用放射配体法检测。结果（1）T1DM患者中CTLA-4＋49A／G基因型GG频率高于健康对照（47．3％比35．1％，OR=1．66，P〈0．01），合并甲状腺自身免疫的T1DM基因型GG频率更高（56．8％，OR=2．43，P〈0．01）。（2）T1DM中CTLA-4CT60基因型GG频率高于健康对照（67．8％比56．7％，OR=1．60，P=0．02），而合并甲状腺自身免疫T1DM患者基因型GG频率更高（77，8％，OR=2．67，P〈0．01）。（3）与甲状腺抗体阴性的T1DM相比，甲状腺抗体阳性的T1DM CTLA-4CT60基因型GG频率更高（77．8％比62．3％，P〈0．05），更易携带谷氨酸脱羧酶抗体（77．8％比57．4％，P〈0．05）。结论CTLA-4＋49A／G和CT60基因多态性与T1DM合并甲状腺自身免疫相关。

超重／肥胖2型糖尿病患者夜间皮质醇水平和微血管并发症的相关性分析

目的 在超重或肥胖的2型糖尿病患者中探讨夜间血清皮质醇水平和糖尿病微血管并发症的相关关系。方法 检测316例超重或肥胖的2型糖尿病患者的夜间0点血清皮质醇，按照不同的皮质醇水平分组，比较各组间糖尿病微血管并发症的状况。所有夜间血清皮质醇＞50nmol／L者行过夜小剂量地塞米松抑制试验，排除亚临床库欣综合征。用化学发光免疫法检测血清皮质醇，同时检查患者发生糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）、糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR）、糖尿病周围神经病变（Diabetic peripheral neuropathy，DPN）的情况。结果 （1）在超重或肥胖的2型糖尿病患者中，DN发生比例在低、中、高皮质醇组逐渐升高，分别为13．3％、27．7％、44．2％，3组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。与低皮质醇组相比，中、高皮质醇组发生DR的比例升高（40．6％和1147．7％对22．7％，均P〈0．01）。高皮质醇组发生DPN的比例高于低皮质醇水平组（60．5％对38．7％，P〈0．01）；（2）有糖尿病微血管并发症的患者夜间血清皮质醇水平较无并发症者高[（136．87±105．78对97．55±93．48）nmol／L，P〈0．01]；与仅合并单个并发症者相比。合并有多个并发症的患者夜间皮质醇水平较高[（151．66±114．54对117．69±90．26）nmol/L，P〈0．05]；（3）单因素相关分析显示，除了女性、年龄、糖尿病病程、空腹血糖以外，高皮质醇水平也是发生2型糖尿病微血管并发症的危险因素。多因素相关分析显示，经过校正病程、空腹血糖、HbA1c使用胰岛素治疗等因素后，夜间0点皮质醇水平仍是发生糖尿病微血管并发症的危险因素（P=0．013）。结论 在超重或肥胖的2型糖尿病患者中，夜间皮质醇水平升高可能是糖尿病伴发微血管并发症的危险因素。

双重糖尿病的临床特征探讨

目的探讨双重糖尿病(DD)的临床特征。方法回顾分析湘雅二医院内分泌科进行胰岛抗体检测的3320例住院糖尿病患者中DD所占比例。根据起病情况,将43例DD患者分层,比较急性起病与缓慢起病者起病时临床特征,并将其与30例1A型糖尿病和30例2型糖尿病比较。动态观察23例DD起病后第6、12、24、36、48、60月血清C肽及糖化血红蛋白等变化情况。结果 (1)DD占该组住院糖尿病患者的2.41‰。(2)与1A型糖尿病比较,急性起病或缓慢起病DD患者BMI及腰臀比均较大,空腹及餐后2小时C肽均较高,而缓慢起病DD患者谷氨酸脱羧酶抗体及蛋白酪氨酸磷酸酶抗体滴度较低,HbA_1c较低,胰岛素抵抗指数较高;与2型糖尿病比较,急性起病DD患者HbA_1c较高,餐后2小时C肽较低,缓慢起病DD患者BMI较大。(3)DD患者胰岛β细胞功能变化呈多样性。结论 DD患者起病时肥胖、伴胰岛自身免疫,残存一定胰岛β细胞功能,较1A型糖尿病胰岛功能更好,临床特征更接近2型糖尿病。

诊断学线上教学的探索与思考

为了保障正常的教学秩序,全力做到"停课不停教、停课不停学",中南大学2019至2020学年第2学期课程教学形式以在线教学为主。诊断学教学团队积极响应学校号召,采用腾讯课堂、微信小程序、模拟教学软件和数字课程平台等多种方式相结合,全面开展线上教学活动。教学结束后,总结前期线上教学经验,并对线上教学方式进行探讨和思索,以期为医学教育改革提供思路和方向。

成人隐匿性自身免疫糖尿病

通常认为典型的1型糖尿病是自身免疫性疾病，而典型的2型糖尿病与自身免疫无关。但是，越来越多的临床证据表明1型和2型糖尿病之间有明显重叠，这对传统的糖尿病分类方法提出了挑战。

酶联免疫斑点直接法与预孵育法检测胰岛抗原特异性T细胞反应的比较

目的探讨酶联免疫斑点(ELISPOT)加速树突状细胞成熟的预孵育法(acDCs)和直接检测法检测1型糖尿病(T1DM)患者外周血中胰岛全长抗原特异性T细胞反应的优劣。方法选取2012年3月至2014年8月中南大学湘雅二医院代谢内分泌科就诊的T1DM患者16例(男9例,女7例),年龄(28.5±9.4)岁,病程6.0(2.8~8.3)个月;另纳入年龄、性别匹配的健康对照12名;ELISPOT-acDCs法和直接检测法检测3种胰岛抗原谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、C肽、胰岛素(INS)特异性干扰素-γ(IFN-γ)分泌性CD4+T细胞反应的斑点数,比较不同检测方法下各种胰岛抗原及联合3种抗原特异性T细胞反应的阳性比例。结果ELISPOT-acDCs法检测T1DM患者GAD65特异性IFN-γ分泌性CD4+T细胞反应的阳性比例为1/16,INS反应阳性比例为6/16,C肽反应阳性比例为4/16,其中INS反应阳性比例高于健康对照组的0/12(P=0.024);联合3种抗原的T细胞阳性比例为9/16,明显高于健康对照组的1/12(P=0.016)。ELISPOT直接法检测GAD65特异性T细胞反应阳性比例为2/16,INS反应阳性比例为1/16,C肽反应阳性比例7/16,其中C肽反应阳性比例高于健康对照组的1/12,但差异无统计学意义(P=0.088)。联合3种抗原检测T细胞反应阳性比例8/16,高于健康对照组的1/12(P=0.039);与直接法比较,仅acDCs法检测下的INS特异性T细胞反应阳性比例较高(P=0.041);两种方法在余各抗原间比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论多种全长胰岛抗原ELISPOT-acDCs法及直接法检测胰岛抗原特异性T细胞反应均可为T1DM患者提供细胞免疫学分型诊断价值;ELISPOT-acDCs法检测INS特异性T细胞反应的灵敏度优于ELISPOT直接检测法。

一例携带BBS10基因复合杂合新突变的巴尔得-别德尔综合征病例报道及文献复习

巴尔得-别德尔综合征(Bardet-Biedl syndrome, BBS)是一种罕见的、高度异质性的常染色体隐性遗传病, 其发病机制为纤毛结构或功能异常。本文就1例BBS10突变的23岁女性BBS患者病例报告进行临床分析, 并复习国内外文献, 提高对该病的认识。