肿瘤相关中性粒细胞的异质性及潜在的临床意义

恶性肿瘤组织中肿瘤相关中性粒细胞(TAN)是肿瘤微环境的重要组成部分。TAN在肿瘤中的作用具有两面性。一方面,TAN可直接杀伤肿瘤细胞,或介导其他免疫细胞协同抗肿瘤。另一方面,TAN也可促进肿瘤血管生成、重塑细胞外基质及参与肿瘤细胞免疫逃逸。以上TAN功能的异质性是其在肿瘤微环境中多种复杂机制的交互调控下形成的,对肿瘤的发展或抑制产生重要的作用。因此,阐明TAN的异质性、不同亚群转化机制及其潜在的临床意义显得尤为重要,不仅有助于开发针对促肿瘤型中性粒细胞亚群的抑制类药物和疗法,还可进一步促进免疫治疗更多获益人群的新评估标准建立和筛选。

一种新的CIITA显性负向突变体的构建和功能研究

II类反式激活因子(CIITA)参与MHC II类基因转录表达的调控,本研究采用RT-PCR等分子克隆技术构建含起始密码子和NLS序列,但是删除N和P/S/T结构域的CIITA突变体质粒pCDNA3.1(+)mCIITA,用脂质体转染法将上述突变体及pCDNA3.1(+)空载体转入来源于BALB/c小鼠的1B4.B6细胞株,用流式细胞术和RT-PCR观察I-A分子表达的影响,并通过混合淋巴细胞反应观察C3H小鼠CD4+T细胞对转入突变体及空载体的1B4.B6细胞的免疫应答强度。结果在细胞和分子水平证实pCDNA3.1(+)mCIITA对1B4.B6细胞I-A的表达起明显抑制作用,强阳性克隆抑制率为90%以上。细胞已基本丧失了对受者CD4+T细胞的刺激能力。以上结果为减低同种异体/异种器官细胞性排斥提供了新的思路和手段。

TRAIL分子胞外区基因工程蛋白的制备与鉴定

目的 制备人TRAIL配体胞外区基因工程蛋白。方法 应用RT PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增TRAIL配体胞外区cDNA ,克隆入PCR2 .1 载体 ,测序验证后用基因重组法构建了TRAIL配体胞外区和组氨酸盒的原核表达质粒pQE hTRAIL。将重组质粒转入大肠杆菌M15中表达 ,经 1mmol LIPTG在 37℃条件下诱导 4h ,亲和层析柱纯化。用SDS -PAGE电泳和Westernblot鉴定表达产物。结果 所表达融合蛋白为人TRAIL配体胞外区分子 ,分子量 30kD。表达量约为 2mg ml。结论 人TRAIL配体胞外区在大肠杆菌中得到良好表达 ,为深入研究TRAIL配体分子在肿瘤与自身免疫病中的可能应用提供了材料。

IL-10的双向免疫调节作用

传统观点认为,同一细胞因子的免疫生物学作用相对固定,间接和直接途径刺激免疫应答或抑制免疫应答,两者选其一,但新近有文献报道同一个细胞因子在不同微环境中可发挥截然不同的免疫生物学作用。此领域中,近来以细胞因子IL-10的双向免疫调节活性最受关注,多年来有关IL-10的负向调节作用及其应用研究不断取得进展,另一方面,其免疫刺激的作用及免疫生物学意义的研究也正逐渐深入,并由此猜测其可能是一种多能细胞因子。本文将结合最新文献,就IL-10正、负向调节的免疫学特性进行综述。

IL-9的研究进展

多种免疫细胞能够分泌细胞因子IL-9,例如Th2、Th9、Th17、Treg细胞、NKT细胞、肥大细胞等。最近有关IL-9的研究又有新进展,本文就IL-9的细胞来源、效应细胞及其免疫生物学功能做简要综述。

天花粉蛋白对结肠癌细胞株CMT-93凋亡及增殖的影响

目的探讨低剂量天花粉蛋白(TCS)对结肠癌细胞株CMT-93凋亡及增殖的影响。方法以不同质量浓度的TCS对体外培养的CMT-93进行干预,设立未添加TCS的CMT-93作为对照组,利用实时细胞动态监测(RTCA)系统检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡,Real-Time PCR检测细胞凋亡相关基因的表达,Western blotting检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt和γ-H2AX蛋白表达以及Akt磷酸化水平(pAkt473和pAkt 308蛋白表达)。结果与对照组比较,5.0μg/mL TCS干预能使CMT-93增殖活性降低,细胞凋亡率升高;促凋亡相关蛋白Bid、Bax、Bad mRNA表达上调;pAkt 473和pAkt 308蛋白表达减少,γ-H2AX蛋白表达增加。结论 TCS对结肠癌细胞株CMT-93具有诱导凋亡和抑制增殖的作用;其机制可能与TCS通过抑制Akt的活性,进而激活促凋亡相关蛋白诱导细胞发生凋亡,以及TCS的DNA损伤作用有关。

重组人可溶性TRAIL分子诱导细胞凋亡机理探讨

目的探讨重组人可溶性TRAIL蛋白(rhsTRAIL)诱导细胞凋亡的机理。 方法应用DNA染料和流式细胞仪定性分别检测rhsTRAIL诱导的细胞凋亡;流式细胞仪检测靶细胞膜表面TRAIL受体表达格局,荧光定量法检测凋亡细胞中Caspase-3活性。 结果100ng/ml人可溶性TRAIL蛋白分子对外周血淋巴细胞无明显毒性,但可诱导肿瘤细胞凋亡,不同的肿瘤细胞凋亡率有差异,凋亡范围在26％-57％。不同细胞表面TRAIL受体表达量不同,外周血淋巴细胞的死亡受体DR4、DR5受体表达5％,而诱骗受体DcRl表达55％,相反肿瘤细胞上的DR4、DR5表达高(40％-88％),而DcRI表达很低(8％-17％)。rhsTRAIL诱导HL-60细胞发生凋亡,其细胞内Caspase-3活性增高。ActD可增加TRAIL抑制细胞生长活性。 结论重组人可溶性TRAIL蛋白分子可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡活性TRAIL受体类型及Caspase-3活性增高有关。

小鼠B7H1-Ig融合蛋白诱导免疫抑制的机制研究

为了探讨小鼠B7H1-Ig融合蛋白诱导免疫抑制的机制,应用抗CD3抗体协同B7H1-Ig融合蛋白刺激纯化的CD4+T细胞,检测其增殖效应和培养上清细胞因子水平的变化,并观察B7H1-Ig对不同品系小鼠混合淋巴细胞反应的抑制作用。发现B7H1-Ig有引起T细胞先增殖后抑制的现象,其抑制作用通过IL-10、TGF-β和受体PD-1,并有调节性T细胞的参与。研究为B7H1-Ig进一步应用于临床疾病的免疫调控打下基础。

B7-H1协同刺激淋巴细胞增殖并诱导产生抑制性T细胞

目的:探讨B7-H1分子在抗原诱导的免疫反应中的作用。方法:在可溶性抗原PPD诱导淋巴细胞增殖体系中,加入中和抗体检测B7-H1的协同刺激作用。转染表达B7-H1的ECV304细胞,观测其对PPD诱导的淋巴细胞增殖、细胞因子分泌及淋巴细胞亚群比例的影响。将刺激后的淋巴细胞过继至自体或同种异体增殖体系中,检测其功能。结果:抗B7-H1中和抗体可降低PPD诱导的淋巴细胞增殖反应和细胞因子分泌;转染B7-H1的ECV304细胞可协同刺激抗原诱导的淋巴细胞增殖,促进细胞因子IL-10的表达,并改变T细胞亚群分布,增加CD4+T细胞亚群比例;自体或同种异体过继实验显示,B7-H1刺激后的淋巴细胞具有显著的免疫抑制功能。结论:B7-H1分子可协同刺激淋巴细胞增殖并诱导产生具有免疫抑制功能的T细胞亚群。

天花粉蛋白免疫抑制作用的功能性肽段筛选及其作用机制

在人工合成天花粉蛋白(Tk)多个重叠肽段的基础上,采用前期工作中筛选出的天花粉蛋白高敏感(C57BL/6)和低敏感(C3H/He)小鼠近交系,建立OVA特异的体外二次应答增殖系统,检测各肽段抑制能力,并通过细胞剔除及过继试验确认发挥作用的细胞,采用ELISA方法检测细胞因子分泌格局的改变。结果筛选到5条具有明显免疫抑制功能的Tk衍生肽,其中PE和PS对两个品系皆显示抑制活性,而PQ、PB及PJ仅在C57BL/6小鼠中诱导抑制。Tk衍生肽段改变了OVA特异性增殖系统中细胞因子分泌的格局,使得以Th1/Tc1型细胞因子为主状态向Th2/Tc2偏移,表现为IL-4和IL-10分泌增加,而IFN-γ分泌减少。剔除CD8+T细胞明显解除Tk及其肽段的抑制作用。表明Tk的某些肽段与全蛋白一样具有免疫抑制功能,其机制可能与诱导T细胞向CD8+Tc2方向偏移有关。

天花粉蛋白(TCS)诱导肿瘤细胞凋亡及其抗肿瘤作用机制的研究进展

天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是一种植物蛋白,具有多种药理学活性。近年来类于TCS抗肿瘤的研究有较多进展,但就其抗肿瘤机制尚未达成共识。一种观点认为,TCS可以诱导肿瘤细胞凋亡;另一种观点认为,TCS可以作为核糖体活性抑制蛋白(ribosome inactivating protein,RIP)不可逆地抑制蛋白质合成,从而发挥抗肿瘤作用。本文就TCS的抗肿瘤机制加以综述。

人血源性间充质干细胞培养与体外成骨研究

目的建立分离、培养成人外周血来源的间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的方法,观察成人血源性MSCs体外成骨潜能。方法抽取成年志愿者外周静脉血30份,每份15ml。用淋巴细胞分离液(密度为1.077g/ml)梯度离心,取单个核细胞在含有20%胎牛血清的α-MEM培养液中培养扩增MSCs,流式细胞仪分析MSCs表型。第2次传代培养时在培养液中添加成骨诱导因子(地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和1,25二羟维生素D3)。第5代传代细胞检测碱性磷酸酶、型胶原(collagentype,Col)、骨钙素(osteocalcin,OC)和骨粘连蛋白(osteonectin,ON)表达,连续培养1个月后检测钙结节形成情况。结果成人外周血中存在MSCs,集落形成率为0.27±0.22/106单个核细胞,表达CD44、CD54、CD105和CD166,而不表达与造血系相关的CD14、CD34、CD45及内皮细胞特异的CD31。地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和1,25二羟维生素D3可作用于传代培养的血源性MSCs,表现为碱性磷酸酶染色阳性细胞增多,逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)产物电泳条带显示ColI、OC和ON表达,盐酸四环素荧光标记证实有钙结节形成。结论建立的成人MSCs分离、培养条件可分选出外周血贴壁生长的细胞中一组独特的细胞群。成人血源性MSCs具有较强的体外成骨潜能,可望成为一种新的骨组织工程种子细胞。

p38 MAPK信号通路在B7H1-Ig融合蛋白诱导Tr1细胞分化中的作用

目的探讨丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号通路在B7H1-Ig诱导Ⅰ型调节性T细胞(Tr1)分化过程中的作用。方法以预包被而固相化的小鼠B7H1-Ig融合蛋白加抗CD3单克隆抗体(单抗)刺激新鲜分离的C57BL/6小鼠初始CD4+CD62L+T细胞,诱导其向Tr1细胞分化。Western blotting检测MAPK信号通路(ERK1/2、p38 MAPK、JNK)的活化状况。在B7H1-Ig开始刺激时分别加入ERK1/2、p38和JNK通路特异性抑制剂PD98059、SB203580和SP600125,分别采用ELISA法、混合淋巴细胞反应(MLR)、流式细胞术和Western blotting分析检测抑制MAPK信号对B7H1-Ig刺激的CD4+T细胞产生的细胞因子分泌格局、功能及Foxp3表达的影响。结果 B7H1-Ig联合抗CD3单抗激活并诱导一群IL-10+IFN-γ+IL-5+IL-4low/-IL-2low/-Foxp3-Tr1细胞,通过分泌抑制性细胞因子IL-10发挥免疫抑制功能。Western blotting检测结果显示B7H1-Ig可激活CD4+T细胞中的p38 MAPK信号通路,对ERK1/2和JNK信号通路无明显影响。抑制p38 MAPK活性,可使B7H1-Ig诱导的CD4+T细胞IL-10和IL-5的分泌减少、免疫抑制功能减弱,促进B7H1-Ig刺激的CD4+T细胞向CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)分化。结论 p38 MAPK信号通路的活化或抑制是参与调控由B7H1-Ig诱导的Tr1细胞分化及其与CD4+CD25+Foxp3+Treg之间相互转化的重要分子机制。

天花粉蛋白及其肽段诱导的免疫抑制依赖APC表面Notch配体的表达

新近发现,Notch信号途径参与调节外周成熟T细胞及其亚群的分化和功能发挥。本研究应用天花粉蛋白及其衍生肽处理骨髓来源的小鼠树突状细胞(DC),检测Notch配体家族分子的表达及DC对CD8+T细胞分泌细胞因子的影响。结果表明,天花粉蛋白或其衍生肽PB处理DC可使Notch配体Jagged1、Delta1分子表达明显增加,并改变CD8+T细胞细胞因子分泌格局,明显抑制Th1相关细胞因子IFN-γ的分泌,而Th2相关细胞因子IL-4和IL-10分泌明显增加。Notch信号的阻断剂可以部分逆转Tk及肽段的抑制作用。表明天花粉蛋白及其衍生肽可诱导一群具有抑制能力的CD8+T细胞,该作用依赖于DC表面Notch配体的表达。

天花粉蛋白合成肽通过诱导CD8抑制性T细胞治疗实验性自身反应性脑脊髓炎

为了探讨天花粉蛋白合成肽(M-Tk)治疗实验性自身反应性脑脊髓炎(EAE)的可能性及其作用机制,应用自身抗原MBP衍生肽MOG35-55免疫C57BL/6小鼠成功地诱发EAE后,以流式细胞术测定小鼠淋巴结细胞及脾细胞T亚群及细胞因子的表达,并通过临床评分观察M-Tk治疗EAE的有效性,包括以HE和LFB染色观察髓鞘病变。结果发现,M-Tk可抑制MOG35-55特异性T细胞的增殖反应,选择性诱导CD8+CD28-T调节细胞的扩增,明显提高IL-10的分泌和降低IFN-γ的产生,并有效改善EAE小鼠神经功能评分。采用M-Tk诱导的CD8 T细胞作体内输注可取得相似甚至更好的治疗效果(P>0.01)。提示M-Tk在体内诱导产生CD8+CD28-抑制性T细胞并上调IL-10分泌降低IFN-γ产生,是对EAE取得疗效的关键。

天花粉蛋白对不同小鼠品系T细胞亚群分化的影响

为进一步探讨不同品系小鼠对天花粉蛋白(Tk)免疫抑制敏感性不同的机制,选择Tk高敏感品系(C57BL/6)和低敏感品系(C3H/He)小鼠,建立OVA特异性体外增殖系统,应用流式细胞术胞内细胞因子染色技术分析Th和Tc细胞亚群,real-time PCR检测细胞因子及相关转录因子的mRNA水平。发现Tk作用下,高敏感品系小鼠C57BL/6 IL-4阳性T细胞明显增多,表达IFN-γ阳性T细胞则显著减少。而低敏感品系C3H/He相关变化不明显。T细胞分化相关细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ及转录因子T-bet、gata-3的基因表达水平也呈现类似的格局。提示Tk发挥免疫抑制作用可能与其诱导的以Th2/Tc2为主的T细胞亚群有关,且这种诱导特定细胞亚群的作用在小鼠中和H-2b基因型相关。

辅助性T细胞亚群的多样性与分化的可塑性研究

通过选择性表达和分泌专一的转录因子和细胞因子,CD4＋Th细胞分为不同的亚群,分别行使不同的免疫生物学功能。不同的CD4＋Th细胞亚群对于维持宿主的防御功能和机体正常的免疫调节有重要作用。

天花粉蛋白合成肽通过激活抑制性CD8^+ T细胞诱导免疫抑制

为了探讨天花粉蛋白合成肽(M-Tk)诱导免疫抑制的机制,应用小鼠针对可溶性抗原OVA的增殖系统,检测M-Tk处理后对淋巴细胞增殖的抑制作用和细胞因子格局的变化,以及M-Tk激活的T淋巴细胞亚群的表型及功能。结果表明,M-Tk可诱导一群CD8+ T抑制性细胞,其表型为CD8+CD28-CTLA4+,采用双层非接触共培养系统发现,该群抑制性细胞主要依赖于细胞因子IL-10、IL-4和细胞间接触发挥免疫抑制作用。

人sCD40L基因的克隆及表达

目的 克隆人ｓＣＤ４０Ｌ基因片段，并在原核细胞中表达。方法用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从激活的人外周血淋巴细胞总ＲＮＡ中，扩增ＣＤ４０Ｌ胞外区ｃＤＮＡ，并克隆至载体ｐＧＥＭ－Ｔ。测序验证后，转至载体ＰＱＥ３１中，并在大肠杆菌Ｍ１５中进行表达，最后通过亲和层析柱得到纯化蛋白。结果纯化所得的产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实，确为人ｓＣＤ４０Ｌ蛋白。结论 应用基因重组法构建了人ｓＣＤ４０Ｌ基因片段，并在原核细胞内成功地进行了表达，为今后进一步研究ＣＤ４０Ｌ与凋亡、疾病的发病机制及临床治疗奠定了基础。

胞内模式识别受体NLR的生物学特性及其在疾病中的作用

Bruce Beutler和Jules Hoffmann因在固有免疫方面的杰出贡献获2011年诺贝尔医学奖。他们发现固有免疫细胞通过TLR（Toll-like receptor）等模式识别受体（Pattern recognition receptor,PRR）识别病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern,PAMP）和损伤相关分子模式（Damageassociated molecular pattern,DAMP）而活化,进而产生免疫效应。