AJUBA调控MST1 YAP1和TAZ因子促进食管鳞状细胞癌细胞体外增殖迁移和侵袭

目的:探讨AJUBA在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞中表达以及是否通过调控MST1、YAP1和TAZ因子影响细胞增殖、侵袭和迁移。方法:采用Western blot法检测AJUBA蛋白在食管癌细胞系KYSE30、KYSE150与KYSE450中的表达水平,构建shRNA干扰载体AJUBA转染至KYSE150食管癌细胞系;通过体外克隆形成实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验探究AJUBA对KYSE150细胞的增殖、周期、迁移和侵袭能力的影响。采用RT-PCR和Western blot检测MST1、YAP1和TAZ mRNA和蛋白的表达;核质分离实验检测AJUBA、YAP1和TAZ蛋白表达情况。结果:稳定干扰AJUBA基因后,平板克隆实验结果显示,与阴性对照组相比,shAJUBA组的细胞克隆形成数量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.001);流式细胞周期实验结果显示,shAJUBA组中的细胞阻滞于G0/G1期,G2/M期与S期细胞显著减少(P<0.05);划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示,与AJUBA空染组相比,shAJUBA组细胞迁移能力和侵袭能力均明显减弱(P<0.001);RT-PCR与Western blot实验结果显示,shAJUBA组细胞中的MST1、YAP1、TAZmRNA与蛋白表达水平均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。核质分离实验结果提示AJUBA蛋白在正常食管鳞状上皮细胞株(SHEE)细胞核中表达,而在KYSE150细胞胞质与胞核中表达;YAP1和TAZ蛋白在SHEE细胞中不表达,在KYSE150细胞质与细胞核中表达,上述结果差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论:AJUBA促进食管癌细胞的增殖、侵袭与迁移,可能与激活MST1、YAP1、TAZ因子的表达而影响食管鳞状细胞癌进展有关。

二乙酰吗啡致大鼠小脑颗粒神经元细胞凋亡过程中C-Jun、Cytc和Caspase-9的作用

背景:二乙酰吗啡药物可导致神经元损伤,但是目前二乙酰吗啡是否诱导神经元细胞凋亡,C-jun、Cytc和Caspase-9因子是否参与此过程尚未见报道。目的:探讨C-jun、Cytc、Caspase-9是否参与二乙酰吗啡诱导神经元细胞凋亡过程。方法:将SD乳鼠小脑颗粒神经元细胞体外培养7 d,采用不同质量浓度二乙酰吗啡(0,10,40,80,100,120 mg/L)干预神经元细胞24 h,在倒置荧光显微镜下观察神经元细胞形态改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用100 mg/L二乙酰吗啡和20μmol/L JNK抑制剂SP600125作用于细胞24 h,通过免疫荧光和蛋白印迹方法检测C-jun、Cytc和Caspase-9蛋白的表达。结果与结论:①在不同质量浓度二乙酰吗啡干预下,随着给药质量浓度的增加,神经元细胞胞体萎缩、亮度降低,部分呈灰黑色,细胞碎裂,神经元网状结构不同程度的消失,细胞改变数量逐渐增加;②随着给药质量浓度的增加,形态改变的细胞数量明显增多(P <0.01),细胞凋亡率也显著增高(P <0.01);③与对照组相比,100 mg/L二乙酰吗啡作用神经元细胞时,二乙酰吗啡组C-jun、Cytc和Caspase-9蛋白呈高表达,差异有显著性意义(P <0.05);与二乙酰吗啡组相比,二乙酰吗啡+SP600125组C-jun、Cytc和Caspase-9蛋白表达明显下调,差异有显著性意义(P <0.05);④结果表明,二乙酰吗啡可诱导小脑颗粒神经元细胞凋亡,C-jun、Cytc和Caspase-9参与了二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡的过程。

Ajuba和YAP1在食管鳞状细胞癌中的表达及相关性

目的探讨Ajuba与yes相关蛋白1(yes-associated protein1,YAP1)在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表达及其与临床病理因素的相关性。方法采用免疫组织化学(SP)法检测ESCC组织中Ajuba与YAP1的阳性表达率。结果Ajuba的阳性表达主要定位于细胞核与细胞质,其在ESCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)。Ajuba的阳性表达与肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移有关(P<0.05)。YAP1的阳性表达主要定位于细胞质,其在ESCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)。Ajuba的阳性表达与肿瘤大小和浸润深度有关(P<0.05)。Ajuba与YAP1在ESCC中的表达呈正相关(P=0.015;r=0.208)。结论Ajuba和YAP1在ESCC中的阳性表达与ESCC的发生密切相关,Ajuba与YAP1未来可能成为ESCC治疗的新靶点。

二乙酰吗啡干预离体乳鼠心肌细胞动作电位和钙离子电流的变化

背景:阿片类药物可调控心肌细胞膜电位和Ca^(2+)电流的变化,但是目前二乙酰吗啡是否诱导心肌节律、细胞动作电位和钙离子电流改变尚未见报道。目的:探讨二乙酰吗啡对离体SD乳鼠心肌细胞动作电位和钙离子电流的影响。方法:(1)体外培养SD乳鼠心肌细胞,采用5个浓度二乙酰吗啡(0,10^(-2),10^(-3),10^(-4),10^(-5)mol/L)和20 mol/L维拉帕米作用于心肌细胞;(2)将细胞分为对照组、二乙酰吗啡组、二乙酰吗啡+维拉帕米组。后2组分别以二乙酰吗啡、二乙酰吗啡+维拉帕米(浓度20μmol/L)联合干预心肌细胞;对照组加入等量PBS。实验于2018-05-21经新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会批准,批准号IACUC201805-K1。结果与结论:(1)当不同浓度二乙酰吗啡干预心肌细胞24 h后,心肌细胞形态异常数量亦随其浓度的改变而明显增加,呈剂量依赖性改变。当二乙酰吗啡浓度逐渐升高,细胞存活数量亦逐渐减少,细胞胞质体积缩小,胞膜收缩,伪足减少,细胞核结构模糊。(2)与对照组相比,当加入二乙酰吗啡干预心肌细胞后,心肌细胞自发性搏动频率和节律差异有显著性意义。静息膜电位负值降低,动作电位中动作电位时程显著增加,动作电位幅度显著减小。(3)与对照组相比,二乙酰吗啡组中心肌膜电位改变数量明显增加,当加入维拉帕米后,心肌膜电位改变细胞数量有所降低。与对照组相比,心肌膜电位改变细胞数量有所升高。(4)提示二乙酰吗啡可致离体SD乳鼠心肌细胞形态异常,心肌自发性搏动频率和节律显著增加,心肌细胞膜电位和动作电位发生改变,钙通道阻滞剂维拉帕米对二乙酰吗啡引起的心肌细胞节律异常有一定改善作用。

AJUBA在食管鳞状细胞癌KYSE150细胞中的功能

目的研究AJUBA对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞迁移与增殖的作用。方法用慢病毒转染AJUBA的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)至KYSE150细胞系,实验分为对照组与敲降组,其中对照组包括KYSE150组(未转染的KYSE150细胞)和KYSE150shnon组(转染随机序列),敲降组为KYSE150shAJUBA组(分别转染KYSE150shAJUBA-1、KYSE150shAJUBA-2、KYSE150shAJUBA-3),并用实时荧光定量法(qRT-PCR)与Western blotting实验共同筛选出敲降效率最高的细胞株进行后续实验。采用细胞计数(Cell Counting Kit-8,CCK-8)增殖实验、Transwell迁移实验检测AJUBA不同表达水平对食管鳞状细胞癌细胞增殖及迁移能力的影响。结果慢病毒转染敲降AJUBA在食管鳞癌细胞中表达,通过qRT-PCR与Western blotting实验表明,对照组与敲降组相比,敲降组中AJUBA在食管鳞癌细胞中表达水平降低,且敲降组中KYSE150shAJUBA-3的AJUBA表达水平最低(P<0.000 1);CCK-8实验结果表明,对照组与敲降组相比,敲降组细胞的增殖能力受抑制(P<0.001);Transwell迁移实验结果表明,对照组与敲降组相比,敲降组的迁移能力明显受抑制,差异有统计学意义(P<0.000 1)。结论 AJUBA在食管鳞状细胞癌中对肿瘤细胞的增殖与迁移能力有促进作用,这有望为食管癌的临床分子靶向治疗提供新的研究方向。

CASQ2和RyR2在二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常中的作用

目的探讨二乙酰吗啡致心肌细胞节律改变与心肌钙离子通道异常之间的关系,探究肌钙集蛋白2(CASQ2)与兰碱尼受体2(RYR2)因子与钙通道之间的联系,明确其是否参与心肌细胞钙离子通道异常及心律失常的过程。方法取出生3日龄SD大鼠乳鼠的心肌细胞进行体外培养,分为正常对照组(N组)、二乙酰吗啡干预组(H组)、二乙酰吗啡加维拉帕米干预组(H+V组),二乙酰吗啡浓度为10^(-4) mol/L,药物作用时间24 h。在荧光倒置显微镜下,观察心肌细胞形态和收缩频率节律改变;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测CASQ2和RyR2因子的mRNA及蛋白表达,观察H组、N组及H+V组上述2个因子表达含量的变化情况。结果 (1)细胞培养:原代心肌细胞形态多样,呈三角形、长梭形和多边形,细胞核圆形或类圆形,大小正常核膜光滑,细胞间通过伪足相互连接,连接成片的细胞搏动节律一致。(2)心肌细胞形态及节律改变:与N组相比,H组和H+V组心肌细胞形态发生一定程度的改变,收缩频率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与N组相比,H组和H+V组中CASQ2和RYR2蛋白和mRNA表达量减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与H组相比,H+V组中CASQ2和RYR2蛋白和mRNA表达量减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论二乙酰吗啡可致心肌细胞自发性搏动频率和节律异常,CASQ2和RyR2因子参与二乙酰吗啡致心肌细胞自发性搏动频率和节律异常的过程。关键字:

OTUB2、TAZ在食管鳞癌中的表达水平及其临床意义

目的探讨Otubain2(OTUB2)、TAZ(含有WW结构域的转录调节因子1)在食管鳞癌(ESCC)中的表达及其临床意义。方法收集新疆医科大学第一附属医院病理科2008-2018年诊断的272例ESCC患者石蜡标本及临床病理资料进行回顾性分析。利用生物信息数据库分析OTUB2在食管癌中的表达情况及与TAZ的相互作用关系;采用免疫组织化学(SP)法检测OTUB2、TAZ在ESCC组织和癌旁组织中的表达,分析其表达变化与ESCC患者临床病理参数及预后的相关性。结果TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库检索分析发现,OTUB2在食管癌中表达显著高于正常食管癌旁组织;STRING数据库检索发现,OTUB2与TAZ存在相互作用关系;免疫组化结果显示,OTUB2蛋白在ESCC组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为87.9%、12.1%,TAZ蛋白在ESCC组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为85.9%、14.1%,差异均具有统计学意义(P<0.05);OTUB2蛋白表达水平与肿瘤大小、分化程度有关(P<0.05);TAZ蛋白表达水平与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05);OTUB2与TAZ在ESCC中的表达水平呈正相关(P=0.000,r=0.216);预后因素分析结果显示,OTUB2与TAZ表达情况、肿瘤大小、浸润深度、有无淋巴转移、与患者的预后均具有统计学意义(P<0.05),OTUB2与ESCC患者中TAZ高表达组的位总生存时间(OS)较低表达组更短(P<0.05)。结论OTUB2与TAZ的表达与ESCC的发展密切相关,有望为ESCC的治疗靶点提供新的参考。