猴金属硫蛋白α域(MT-α cDNA)突变体的构建、表达及工程菌对重金属的吸附

采用PCR技术和同尾酶手段,构建了猴金属硫蛋白(mMT)α域的串连体,并构建了表达MTα串连体的工程菌,获得了表达二聚串连体(MTα2)、三聚串连体(MTα3)、五聚串连体(MTα5)的工程菌.结果表明,工程菌在0.1mmol·L-1IPTG诱导3h后表达量最高.Cd2+浓度为0.5mmol·L-1时,对照菌pGEX-2T/BL21生长受到严重胁迫,工程菌表现出较强的抗性,MTαn/BL21(n=2、3、5)生长几乎不受到胁迫;Cd2+浓度为1.0mmol·L-1时,MTα5/BL21表现出较强的耐受能力.Cd2+浓度为0.5mmol·L-1时,工程菌对镉的富集能力明显高于对照,其中富集能力最强的是MTα3/BL21(76%).与对照pGEX-2T/BL21相比,MT/BL21对锌吸附能力显著提高,而转化有MTα串连体基因的工程菌对锌的吸附能力没有提高,说明工程菌对Cd2+的吸附特异性增强.结构预测显示,MTα、MTα2、MTα3的二级结构中α螺旋依次增加,推测突变蛋白的疏水性增强,三维结构稳定.MTα4、MTα5二级结构中,α螺旋数目减少,尤其是MTα5,其α螺旋几乎完全遭到破坏,疏水性大为降低.对基因工程菌吸附镉的实验表明,MTα3/BL21对镉具有较高的特异性和富集容量.

细菌表面展示技术及其在环境重金属污染修复中的意义

从细菌表面展示系统构成、载体蛋白的选择和细菌表面展示策略等方面综述了细菌表面展示技术及其发展,分析了它们的优缺点,指出了细菌表面展示技术用于重金属污染修复存在的问题,提出了解决问题的思路和方法。

小球藻Δ12脂肪酸去饱和酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的Δ12脂肪酸去饱和酶基因序列的保守区域,设计简并引物,通过RT-PCR的方法获得了小球藻NJ-7的内质网型Δ12脂肪酸去饱和酶基因(CvFAD2)的部分序列,然后采用RACE的方法分别克隆到5′片段和3′片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。该基因全长为2 032 bp,ORF为1 158 bp,编码385个氨基酸,分子质量约为44 ku。根据已经得到的CvFAD2序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FAD2氨基酸序列相比较,同源性分别为普通小球藻(Chlorella vulgaris)75%,莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)57%,石榴(Punica granatum)57%,麻疯树(Jatropha curcas)52%。系统发育分析表明,南极小球藻CvFAD2基因与真核微藻(衣藻和普通小球藻)的FAD2基因聚在一起,介于真菌与高等植物之间,并且真核微藻FAD2基因与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近。

莱茵衣藻FAB2的原核表达以及不同胁迫条件下的表达模式

脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase)是不饱和脂肪酸合成途径的关键酶,催化脂肪酸链的特定位置脱氢形成双键,其通过引入双键调节脂肪酸不饱和度,以适应周围环境的变化。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)质体酰基-酰基载体蛋白去饱和酶(plastid acyl-ACP desaturase,FAB2)在Δ9位脱氢,催化脂肪酸中第1个双键的形成。本文首先在大肠杆菌中异源表达了FAB2,另外将其氨基酸序列与其他高等植物、微藻、真菌等进行了多序列比对以及系统进化分析,推测其与高等植物亲缘关系更近。利用定量RT-PCR技术研究了衣藻FAB2基因不同胁迫条件下的表达模式,结果表明4℃+0%NaCl,25℃+1%NaCl胁迫条件下FAB2基因表达量都有一定程度升高。

微拟球藻Ⅰ型脂酰辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶编码基因NoDGAT1A的功能分析

从微拟球藻高产油藻株IMET1的cDNA中,克隆出一个I型脂酰辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶的编码基因NoDGAT1A,该基因共编码437个氨基酸,与拟南芥I型DGAT的氨基酸序列相似度为38%,且含有至少9段高疏水区。随后,NoDGAT1A被转化入营养缺陷型酿酒酵母三脂酰甘油合成突变株H1246中进行诱导表达。结果表明,在外加二十碳五烯酸(EPA)时,表达No DGAT1A的H1246能够产生三脂酰甘油(TAG),针对其TAG的分析表明,与酵母DGAT相比,表达NoDGAT1A的H1246产生的TAG中含有更多的EPA,说明NoDGAT1A具有更强的合成含EPA的TAG之能力。此外,16:0(63.82%)和18:0(27.98%)是其TAG中主要的脂肪酸链成分,说明NoDGAT1A合成的TAG侧链仍以长链饱和脂肪酸为主。NoDGAT1A对微拟球藻中TAG的合成具有重要作用,也为以微拟球藻为模式的产油微藻TAG和EPA代谢网络提供参考。

三角褐指藻基因枪转化体系的建立

三角褐指藻具有较高的脂肪酸含量,是一种很有潜力的生物柴油生产原料。此外,它是多不饱和脂肪酸尤其是二十碳五烯酸(EPA)重要的来源。合适转化体系的缺乏限制了通过基因工程手段对其进行改造。首次采用基因枪方法成功地将外源基因转入三角褐指藻,转化细胞经染色后呈现蓝色,表明外源报告基因β-糖苷酸酶(GUS)基因得到了成功的表达。同时还进行了转化参数等因素对转化效率影响的分析,优化了转化条件。结果显示最佳的转化条件为:每60μg钨粉包被1μg质粒DNA,样品室真空度为27英寸汞柱,可裂膜为1500psi,受体与阻挡网距离6cm。此外,转化载体采用了三角褐指藻内源基因fcp的启动子,实现了外源基因在细胞内的表达。通过5种基因工程中常用抗生素对三角褐指藻生长抑制的研究发现,三角褐指藻对卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素和新霉素不敏感,500mg/L的卡那霉素、氨苄青霉素和新霉素,以及1000mg/L链霉素仍不能抑制其生长;三角褐指藻对氯霉素非常敏感,130mg/L的氯霉素可以完全抑制其生长,其半抑制浓度为60mg/L。这为基因工程手段改造三角褐指藻脂肪酸代谢相关途径奠定了基础。

利用海洋微拟球藻生产蜂王浆主效成分24-亚甲基胆固醇的研究

用于生产生物燃料的微藻生物技术正处于十字路口,但仍在不断发展。微藻衍生的多产品技术的发展将大大提高经济可行性,特别是结合生产高附加值化合物。研究结果表明敲除海洋微拟球藻中的DWARF1(DWF1)基因的突变株具有比野生型更高的色素含量和光合效率,并且还可以显著降低胆固醇积累(这可能是人类心血管疾病的主要危险因素),使其从原本占总甾醇(TSs)超过70%的含量减少至零。相比之下,其前体24-亚甲基胆固醇(一种对人类健康有益的蜂王浆的关键微量营养素)的产量则从零增加到60%以上。结合海洋微拟球藻中ω-3脂肪酸含量高的特点,我们预计在工业规模上开发该菌株将带来可观的利润。