艾灸对实验性RA家兔滑膜NLRP3炎性小体、Caspase-12表达的影响

目的观察艾灸对实验性类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)家兔滑膜组织中NLRP3炎性小体、Caspase-12表达的影响,探索艾灸对RA家兔抗炎作用的机制。方法将24只日本大耳白兔根据体质量和性别随机分为3组:对照组、模型组、艾灸组。将弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant,FCA)按照同等剂量(0.5 mL·kg^(-1))注射到各组(模型组、艾灸组)实验动物双侧后膝关节腔内,对照组各动物于该位置处注入同等体积的生理盐水用作对照。对艾灸组家兔双侧“肾俞”、“足三里”穴进行无瘢痕艾灸,每天每穴5壮,连续治疗6天,休息1天,为1个疗程,共治疗3个疗程。光镜下观察家兔膝关节滑膜样本的组织形态学改变,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测家兔膝关节滑膜组织中NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、Caspase-12的mRNA表达,酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测实验动物滑膜液中IL-1β(白细胞介素1β)的含量变化。结果相较于对照组,模型组滑膜的炎性细胞浸润程度、滑膜组织增生程度、纤维组织增生程度、巨噬细胞增生程度等病理改变及病理评分增加(P<0.05),NLRP3、Caspase-1 mRNA的表达升高(P<0.05),Caspase-12 mRNA的表达显著下降(P<0.01),IL-1β的表达显著升高(P<0.01);与模型组相比,艾灸组滑膜病变程度以及病理评分均有所减少(P<0.05),NLRP3、Caspase-1 mRNA的表达下降(P<0.05),Caspase-12 mRNA的表达显著上升(P<0.01),IL-1β的表达降低(P<0.05)。结论艾灸对RA家兔膝关节滑膜炎症病理过程具有明显的抑制作用;艾灸“肾俞”、“足三里”穴可上调Caspase-12表达进而抑制NLRP3炎性小体,可能是艾灸减轻RA炎症反应的机制之一。

基于PTPN22干扰的艾灸对实验性类风湿性关节炎家兔滑膜细胞JAK1-STAT4信号通路的影响

目的:研究艾灸对实验性类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大耳白兔滑膜组织非受体22型蛋白酪氨酸磷酸酶基因(protein tyrosine phosphatase,nonreceptor type 22,PTPN22)、JAK1及STAT4表达的影响,探索慢病毒介导的PTPN22干扰对艾灸治疗实验性RA大耳白兔滑膜细胞JAK1-STAT4信号通路的影响。方法:日本大耳白兔随机分为对照组、模型组、艾灸组、PTPN22干扰组,6只/组。将FCA按0.5 mL/kg注入模型组、艾灸组及PTPN22干扰组动物双后腿膝关节腔内造模,对照组同法注入无菌生理盐水。将慢病毒介导的PTPN22 RNAi作为干预手段,艾灸组及PTPN22干扰组动物双侧“肾俞”“足三里”穴进行小艾炷灸治疗。治疗前后测量各大耳白兔左、右膝关节周长,治疗第21天行滑膜取材,采用RT-PCR法检测滑膜组织PTPN22 mRNA、JAK1 mRNA及STAT4 mRNA表达;采用Western blot法检测滑膜组织PTPN22蛋白表达情况。结果:与对照组相比,模型组大耳白兔双膝关节周长、JAK1 mRNA及STAT4 mRNA的表达升高(P<0.05),PTPN22 mRNA及蛋白的表达降低(P<0.05);与模型组相比,艾灸组大耳白兔双膝关节周长、JAK1 mRNA及STAT4 mRNA的表达降低(P<0.05),PTPN22 mRNA及蛋白的表达升高(P<0.05);与艾灸组相比,PTPN22干扰组大耳白兔双膝关节周长、JAK1 mRNA及STAT4 mRNA的表达升高(P<0.05),PTPN22 mRNA及蛋白的表达降低(P<0.05)。结论:艾灸可能通过PTPN22途径良性调控RA中JAK-STAT通路异常激活的JAK1与STAT4基因表达水平,负向调节JAK1-STAT4信号通路而达到抗炎治疗效应,其对JAK1-STAT4信号通路的调控可能是艾灸治疗RA抗炎效应实现的途径之一。

基于慢病毒介导的NLRP3过表达对艾灸调控实验性RA家兔关节滑膜液anti-CCP、RF水平的影响

目的观察艾灸对实验性类风湿性关节炎(RA)家兔的抗炎消肿作用,通过在RA家兔实验模型过表达由慢病毒载体介导的NOD样受体相关蛋白3(NLRP3),研究艾灸对其膝关节滑膜液中抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-CCP)、类风湿因子(RF)、白细胞介素-18(IL-18)含量的影响及其NLRP3调控机制。方法日本大耳白兔30只,随机分为空白组、模型组、艾灸组、NLRP3过表达组、NLRP3阴性对照组,每组各6只动物。福氏完全佐剂(FCA)平均注入家兔双膝关节腔(0.5 mL·kg^(-1))。RA模型塑造后第3天及治疗后第10天,将NLRP3过表达慢病毒载体(Lv-NLRP3-GFP)10μL注入NLRP3过表达组兔双后膝关节腔,NLRP3阴性对照组家兔同法注入等量携带GFP的慢病毒载体(LvGFP)作对照。艾柱灸艾灸各组家兔双侧“肾俞”、“足三里”穴(5壮/穴/天,6天1疗程,疗程间间隔1天,3个疗程)。治疗后观测各家兔左、右后膝关节周长,ELISA法检测关节滑膜液中anti-CCP、RF、IL-18的含量。结果与空白组比较,模型组左、右膝关节周长增大,膝关节滑膜液anti-CCP、RF、IL-18含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,艾灸组左、右膝关节周长缩小,膝关节滑膜液anti-CCP、RF、IL-18含量显著降低(P<0.01);与艾灸组相比,NLRP3过表达组左、右膝关节周长增大(P<0.05),膝关节滑膜液anti-CCP、RF、IL-18含量升高(P<0.05)。结论艾灸对实验性RA家兔具有抗炎效应,艾灸“肾俞”、“足三里”穴可显著降低RA家兔膝关节滑膜液中免疫效应因子anti-CCP、RF以及炎性细胞因子IL-18的含量,在NLRP3过表达的情况下其作用显著降低,提示艾灸抑制实验性RA家兔异常免疫功能,从而实现其抗炎调节作用可能与NLRP3的表达情况有密切关联。

艾灸对实验性类风湿性关节炎家兔滑膜组织NLRP3炎性小体激活因素Cathepsin-B、ROS水平的影响

目的观察艾灸对类风湿性关节炎(RA)的抗炎消肿作用,研究艾灸对实验性RA家兔滑膜NLRP3 mRNA、组织蛋白酶B(Cathepsin-B)mRNA的表达和活性氧(ROS)含量的影响,探索艾灸对RA中NLRP3炎性小体激活状态的影响。方法日本大耳白兔24只,按体质量、性别分层,随机分为空白对照组(简称空白组)、RA模型组(简称模型组)、艾灸治疗组(简称艾灸组),每组8只。将弗氏完全佐剂(FCA)按0.5 mL/kg体质量剂量注入模型组、艾灸组动物双膝关节腔内。同法将等量的无菌生理盐水注入空白组动物作为对照。艾灸治疗艾灸组动物双侧“肾俞”“足三里”,每穴各5壮,每日1次。6 d为1个疗程,共治疗3个疗程,疗程之间休息1 d。治疗后观测各家兔左、右膝关节周长,治疗后第21天进行膝关节滑膜组织取材,采用RT-PCR法检测各组家兔膝关节滑膜组织中NLRP3 mRNA、Cathepsin-B mRNA的表达;采用ROS检测试剂盒检测各组家兔膝关节滑膜组织中ROS的含量。结果造模后白兔双膝关节周长较空白组明显增高(P<0.01);艾灸治疗后白兔双膝关节周长较模型组显著下降(P<0.05)。与空白组比较,模型组的NLRP3 mRNA、Cathepsin-B mRNA的表达和ROS荧光强度均显著升高(P<0.01);而与模型组比较,艾灸组的NLRP3 mRNA、Cathepsin-B mRNA的表达和ROS荧光强度均降低明显(P<0.05)。结论艾灸对实验性RA家兔膝关节滑膜炎症过程具有明显的抑制作用;艾灸“肾俞”“足三里”穴通过下调Cathepsin-B的表达和抑制ROS的生成从而抑制NLRP3的激活可能是艾灸治疗RA改善其病理过程的机制之一。

艾灸对实验性RA家兔滑膜组织CXCL12/CXCR4-NF-κB信号通路的影响

目的观察艾灸对类风湿性关节炎的抗炎效应,研究艾灸对实验性RA家兔滑膜组织CXCL12 mRNA、CXCR4 mR-NA、NF-κB p65 mRNA、IκBαmRNA的表达及滑膜液TNF-α、IL-1β的含量的影响,探索艾灸对实验性RA滑膜组织CXCL12/CXCR4-NF-κB信号通路的影响。方法日本大耳白兔21只,按体重、性别分层,随机分为空白对照组(简称对照组)、RA模型组(简称模型组)、艾灸治疗组(简称艾灸组),每组7只。按0.5mL/kg将弗氏完全佐剂(FCA)注入模型组、艾灸组家兔双后膝关节腔内。对照组同法注入无菌生理盐水作为对照。艾灸治疗艾灸组动物双侧“肾俞”“足三里”穴,每穴各5壮,每日1次。6天为1个疗程,共治疗3个疗程,疗程之间休息1天。治疗后测量各组家兔左、右后膝关节周长,治疗后第21天进行滑膜取材,采用RT-PCR法检测各组家兔膝关节滑膜组织中CXCL12 mRNA、CXCR4 mR-NA、NF-κB p65 mRNA、IκBαmRNA的表达;采用ELISA法检测各组家兔膝关节滑膜液TNF-α、IL-1β的含量。结果造模后家兔双侧后膝关节周长较对照组显著增高(P<0.01);艾灸治疗后家兔双侧后膝关节周长较模型组明显下降(P<0.05)。与对照组比较,模型组家兔的CXCL12 mRNA、CXCR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA、IκBαmRNA的表达和TNF-α、IL-1β的含量均明显升高(P<0.05);而与模型组比较,艾灸组家兔的CXCL12 mRNA、CXCR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA、IκBαmRNA的表达和TNF-α、IL-1β的含量均明显降低(P<0.05)。结论艾灸对实验性RA家兔有明确的抗炎消肿作用,其机制可能与良性调控滑膜组织CXCL12/CXCR4-NF-κB信号通路,抑制炎性细胞因子的分泌有关。

艾灸在NLRP3炎性小体过表达下对佐剂性关节炎家兔膝关节滑膜组织JAK2-STAT3信号通路的影响

目的:通过慢病毒载体介导NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体在佐剂性关节炎(AA)家兔中过表达,观察艾灸对AA家兔Janus蛋白酪氨酸激酶2-信号转导和转录激活因子3(JAK2-STAT3)信号通路及滑膜液白细胞介素(IL)-1β、IL-18的影响,探讨艾灸治疗类风湿性关节炎的可能机制。方法:将28只家兔随机分为对照组、模型组、艾灸组、NLRP3过表达组,每组7只。采用弗氏完全佐剂注射法制备AA家兔模型。造模后第3天,将NLRP3过表达慢病毒载体注入NLRP3过表达组家兔双侧后膝关节腔内。造模后第7天,艾灸组、NLRP3过表达组给予艾炷灸双侧“肾俞”“足三里”治疗,5壮/穴,1次/d,6 d为1个疗程,疗程间间隔1 d,共3个疗程。造模后第6天、治疗第6天及治疗结束后测量家兔双后膝关节周长。采用ELISA法检测家兔膝关节滑膜液中IL-1β、IL-18的含量,实时荧光定量PCR法检测家兔膝关节滑膜组织中NLRP3、JAK2、STAT3 mRNA表达。结果:与对照组比较,模型组家兔左、右膝关节周长及膝关节滑膜液中IL-1β、IL-18含量增加(P<0.05),滑膜组织中NLRP3、JAK2、STAT3 mRNA表达均升高(P<0.05);与模型组比较,艾灸组左、右膝关节周长缩小(P<0.05),膝关节滑膜液中IL-1β、IL-18含量及膝关节滑膜组织中NLRP3、JAK2、STAT3 mRNA表达均降低(P<0.05);与艾灸组比较,NLRP3过表达组左、右膝关节周长及膝关节滑膜液中IL-1β、IL-18含量增加(P<0.05),膝关节滑膜组织中NLRP3、JAK2、STAT3 mRNA表达均升高(P<0.05)。结论:艾灸可能通过调控JAK2-STAT3信号通路发挥对AA家兔的抗炎消肿作用,其治疗效果可能与NLRP3表达密切相关。

基于慢病毒介导的NLRP3过表达对艾灸调控实验性RA家兔关节滑膜组织ASC、Caspase-1水平的影响

目的通过慢病毒载体介导的NLRP3炎症小体在实验性类风湿性关节炎(RA)动物模型过表达,研究艾灸对实验性RA家兔滑膜组织分泌ASC、Caspase-1的影响及NLRP3炎症小体的调控机制。方法日本大耳白兔30只,按体重、性别分层,随机分为空白对照组(简称对照组)、RA模型组(简称模型组)、艾灸治疗组(简称艾灸组)、艾灸治疗+NLRP3过表达组(简称NLRP3过表达组)、艾灸治疗+NLRP3过表达阴性对照组(简称NLRP3阴性对照组),每组6只。造模将弗氏完全佐剂(FCA)按0.5mL/kg体重剂量平均注入兔双后侧双膝关节腔内,对照组采用同样方法注入无菌生理盐水作为对照。造模后第3天,应用微量注射器将NLRP3过表达慢病毒载体40μL(滴度1.0×10^(11)TU/ml),用生理盐水配置成0.34ml溶液,于髌韧带附近缓慢注入NLRP3过表达组兔双侧后膝关节腔内,NLRP3阴性对照组家兔同法注入等量LvGFP作阴性对照,艾炷灸艾灸组、NLRP3过表达组、NLRP3阴性对照组双侧“肾俞”“足三里”穴治疗实验性RA(5壮/穴/天,6天为1个疗程,共治疗3个疗程,疗程之间休息1天)。造模前及治疗后第3、6、9、12、15、18、21天分别测量各动物左右膝关节周长。治疗后第21天进行滑膜组织取材,运用采用RT-PCR检测NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA基因蛋白表达情况。结果造模前,左、右膝关节周长各组间无显著性差异(P>0.1);模型组各个时间点左、右膝关节周长均较对照组明显增大(P<0.01);治疗后艾灸组左、右膝关节均较模型组减小(P<0.05);与艾灸组、NLRP3阴性对照组比较,NLRP3过表达组左、右膝关节周长显著增大(P<0.01);与艾灸组比较,NLRP3阴性对照组左、右膝关节周长无显著差异(P>0.05)。与对照组比较,模型组NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA含量极显著升高(P<0.01);与模型组比较,艾灸组NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA含量极显著降低(P<0.05);与艾灸组、NLRP3阴性对照组比较,NLRP3过表达组NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA含量极显著升高(P<0.01)。与艾灸组相比,NLRP3阴性对照组NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA基因表达值含量无显著差异(P>0.1),不具备统计学意义。结论艾灸具有抗炎消肿作用,类风湿性关节炎滑膜组织炎症及关节功能障碍可能与关节滑膜组织中NLRP3炎症小体过度活化有关,艾灸“肾俞”“足三里”穴治疗RA可能与抑制ASC、Caspase-1的产生,抑制NLRP3炎症小体的过度活化有关,但在NLRP3炎症小体过表达的情况下其作用明显降低。