咪喹莫特(imiquimod)联合树突状细胞降低荷黑素瘤小鼠调节性T细胞并增强抗肿瘤效果

目的观察联合应用Toll样受体7(TLR7)激动剂咪喹莫特(imiquimod)和负载肿瘤相关抗原的树突状细胞(DC)疫苗对荷黑素瘤小鼠的治疗作用并探讨相关机制。方法培养表达卵白蛋白的B16黑素瘤(B16-OVA)细胞,注射入C57BL/6小鼠皮下制备荷瘤小鼠模型。含重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rm GM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rm IL-4)的培养液扩增培养骨髓来源的DC,加入OVA过夜孵育制备负载OVA的DC疫苗(OVA-DC)。荷瘤小鼠分别采用PBS、咪喹莫特局部涂抹、OVA-DC皮内注射、咪喹莫特联合OVA-DC进行治疗,数字游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的生长情况。流式细胞术检测荷瘤小鼠外周血CD4^+FOXP3^+调节性T细胞(Treg)的比例。采用上述方案免疫小鼠后,用CCK-8法检测小鼠脾脏淋巴细胞对B16-OVA细胞的杀伤效应。结果与单纯咪喹莫特、OVA-DC治疗组及PBS对照组相比,咪喹莫特联合OVA-DC治疗组荷瘤小鼠黑素瘤体积较小,荷瘤小鼠CD4^+细胞中FOXP3^+Treg比例明显降低。咪喹莫特联合OVA-DC免疫小鼠脾脏淋巴细胞杀伤B16-OVA肿瘤细胞能力较其他组明显增强。结论咪喹莫特联合负载抗原的DC疫苗可诱导荷瘤机体CD4^+FOXP3^+Treg比例降低并增强抗肿瘤效果。

Compound 48/80活化的肥大细胞对树突状细胞归巢的影响

目的:检测compound 48/80(C48/80)活化的肥大细胞对树突状细胞(DC)向局部引流淋巴结迁移的影响,初步探讨C48/80增强适应性免疫应答的机制。方法:体外培养C57BL/6小鼠骨髓来源的DC(BM-DC)和MC/9肥大细胞,Transwell趋化小室实验检测C48/80处理的MC/9细胞对BM-DC向趋化因子CCL21迁移的影响。甲苯胺蓝染色法检测小鼠肩背部皮肤注射C48/80后肥大细胞脱颗粒状态;流式细胞术检测肩上和腋窝淋巴结CD11c+DC的数量。小鼠肩背部两侧各注射荧光微球标记的BM-DC,制备局部引流淋巴结冷冻切片,荧光显微镜观察C48/80处理对外源性DC归巢的影响。采用负载卵白蛋白的BM-DC(OVA-DC)免疫C48/80处理及对照小鼠,WST-8试剂检测局部引流淋巴结淋巴细胞的增殖活性。结果:采用小鼠骨髓细胞成功培养并获得大量典型的BM-DC。MC/9肥大细胞活化上清可促进BM-DC向CCL21迁移(P<0.01)。皮内注射C48/80后30 min可诱导局部皮肤明显肥大细胞脱颗粒。C48/80注射部位24 h出现明显炎细胞浸润,局部引流淋巴结细胞总数和DC细胞数量增多。注射荧光微球标记的BM-DC后48 h淋巴结冷冻切片显示C48/80处理侧荧光阳性的DC细胞数量明显多于C48/80未处理侧。OVA-DC免疫小鼠显示C48/80处理组抗原特异性淋巴细胞增殖能力较对照组明显增高(P<0.05)。结论:C48/80诱导的肥大细胞活化能够促进DC向局部引流淋巴结归巢,增强特异性淋巴细胞增殖能力,参与适应性免疫应答。

FTH敲除前列腺癌PC-3细胞株的转录相关蛋白分析

目的利用本实验室已经建立的铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)敲除的前列腺癌PC-3细胞株,分析FTH表达降低引发的细胞内蛋白质变化,探讨FTH对前列腺癌(prostatic cancer,PC)病理生理过程的生物学影响。方法实验分为3组:空白对照组(未经处理的PC-3细胞),NC组(感染空载体病毒的阴性对照组),LV-sh FTH组(利用sh FTH病毒敲除FTH组)。Western blot实验确定FTH敲除效率后,利用质谱分析技术对感染细胞的蛋白表达情况进行检测,所得的质谱分析结果采用t检验进行差异分析(P<0.01,fold change>1.2),所得差异蛋白采用GO分析方法对差异蛋白质进行筛选分类及功能分析。结果对质谱分析结果中差异表达蛋白质进行GO分析,LV-sh FTH组与NC组相比,生物过程——RNA加工(RNA processing)中涉及的下调表达蛋白质最多共24个,分别为基因RPL8、WDR46、BOP1、RPL15、NOP56、UTP18、RS23、DDX27、PES1、UTP20、CDKN2A、DIS3、RPL6、RPL19、RPS8、RPL4、NOP58、UTP6、FCF1、DDX49、RCL1、UTP15、BMS1、IMP4所表达的产物。结论通过质谱分析鉴定出的差异蛋白结果,为后期验证FTH的生物学功能及为临床寻找新的前列腺癌早期诊断肿瘤标志物提供理论依据和基础。