CRISPR/Cas技术可有效介导家鸡基因敲除

本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据。基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP(chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率。Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%。通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除。

脂代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控机制

【目的】探索家鸡雄性生殖细胞分化过程中脂代谢相关基因以及信号通路的调控机制,以期为完善体外诱导体系提供依据。【方法】采用流式细胞分选法获得纯度较高的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(primitive germ cells,PGC)和精原干细胞(spermatogonial stem cell,SSC),提取细胞总RNA。利用RNA-seq高通量分析方法对这三种细胞进行转录组水平测序,进行GO(Gene ontology)分析和KEGG通路富集,寻找脂代谢相关基因以及信号通路;并利用脂代谢--视黄醇代谢通路终产物视黄酸(retinoic acid,RA)以及抑制剂苯磺酰异羟肟酸(piloty’s acid)在体外诱导ESC向雄性生殖细胞分化和体外鸡胚注射后孵化,q RT-PCR(quantitative real time PCR)检测视黄醇代谢通路上差异基因的表达变化,与RNA-seq结果进行比较分析同时检测雄性生殖细胞标记基因的变化情况。【结果】GO功能显著性富集和Pathway显著性富集分析结果发现:在ESC向SSC分化过程中共存在328个基因持续参与脂代谢调控,富集到27条脂代谢通路中,包括视黄醇代谢、初级胆汁酸的合成、甾类激素的生物合成、脂肪酸代谢、甘油酯代谢以及类固醇的生物合成等通路。在视黄醇代谢通路中ADH5在PGC中特异表达,ALDH1A1在整个发育过程中持续上调,ADH5和ALDH1A1在细胞中参与视黄酸的合成;CYP26b1在整个发育过程中持续上调,参与视黄酸的降解过程;RA体外诱导ESC向SSC方向诱导试验结果表明ADH5、ALDH1A1和CYP26b1家族基因在体外RA诱导过程中变化与体内分化过程一致,RA诱导组产生的SSC样细胞显著高于控制组和Piloty’s Acid+RA组。鸡胚注射抑制剂试验结果表明视黄醇通路被抑制后孵化至18d后SSC细胞表面特异标记基因integrinα6和integrinβ1的表达水平显著的低于正常的孵化组(CON)和阴性对照组(BLANK)【结论】脂代谢--视黄醇代谢通路在家鸡雄性生殖细胞的分化过程中起重要作用,体外利用视黄醇代谢通路终产物RA进行诱导时第2天出现类胚体,第4、6天类胚体逐渐增大,第8天开始裂解,在第10天出现SSC样细胞,而在诱导过程中抑制视黄醇通路信号后则会降低SSC样细胞的产生,而在体外孵化过程中视黄醇通路抑制后也能影响SSC细胞的产生。

蛋白质代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控

【目的】探究蛋白质代谢在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外向雄性生殖细胞诱导分化体系研究提供依据。【方法】采用流式分选的方法获取高纯度的ESC、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(spermatogonia stem cell,SSCs),分别提取细胞的总RNA,采用RNA-Seq方法对3种细胞的转录本进行深度测序,然后进行WEGO(web gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,筛选出鸡雄性生殖细胞分化过程中参与蛋白质代谢的关键通路及其关键基因,RT-q PCR(Real time Quantitative PCR)检测部分关键差异基因的表达变化,并与RNA-Seq(RNA sequencing)结果进行比较分析,同时分别从体内和体外水平对关键基因NOS2进行抑制,观察各分组不同天数的细胞形态变化及检测NOS2和C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因表达变化情况。【结果】在雄性生殖细胞分化的整个阶段,有697个差异基因参与生物代谢,显著富集于精氨酸-脯氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路以及色氨酸代谢通路,在这3条通路上筛选出NOS2、FAH和IDO等关键性基因,这些基因的在ESCs向SSCs分化过程中表达变化趋势与其在RNA-Seq中的结果一致。体内抑制NOS2基因后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因在空白组和对照组之间无显著性的差异,而在抑制剂组中,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的m RNA表达量均出现了降低;而体外抑制NOS2基因后,对照组中的ESCs在2、4、6、8和10d内细胞不断增殖,但是未出现类胚体;RA诱导组中,2d出现小的类胚体,4d类胚体增大,且数量增多,6d类胚体边缘开始出现破裂,8d类胚体解体,10d出现类精原样细胞;抑制剂组中,ESCs在2、4、6、8和10d内无类胚体出现,且相较于对照组细胞增殖缓慢;RA+抑制剂组中,2和4d内无类胚体出现,细胞增殖缓慢,6d出现小的类胚体,8d类胚体数量少量增多,且体积稍显增大,10d类胚体开始裂解。并且经过抑制剂的抑制后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的表达量在RA诱导组、抑制剂组和RA+抑制剂组中相对于对照组均呈显著性或极显著性的下调趋势。【结论】基于RNA-Seq技术及生物信息学方法筛选出ESCs向雄性生殖细胞分化过程中精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2的基础上,通过对NOS2基因在鸡体内和体外的抑制,发现NOS2在被抑制后,ESCs向雄性生殖细胞分化的过程受到抑制。说明了精氨酸-脯氨酸代谢通路及关键基因NOS2对ESCs向雄性生殖细胞分化过程中起到重要的调节作用。

悬滴培养法促进鸡胚胎干细胞形成类胚体

本研究旨在通过悬浮培养法培养鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs),摸索鸡胚胎干细胞形成类胚体(Embryoid body,EB)的最佳方案,以期提高鸡胚胎干细胞体外诱导效率。将鸡ESCs培养传代至第3代,采用1×104、3×104和6×104 mL-13个细胞浓度,使用悬滴培养后,观察类胚体的形成效率。对悬滴培养形成的类胚体进行形态学观察,qRT-PCR检测干细胞标记基因的表达,免疫细胞化学检测相关蛋白的表达,并进行类胚体自分化检测和核型分析。3×104 mL-1细胞浓度生成的类胚体数量最高,单个视野下可观察到约267个类胚体,且形成的类胚体大小均一,呈圆球状。qRT-PCR检测结果表明,在类胚体形成48h内,干细胞标记基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit仍维持表达。免疫细胞化学检测显示,该方法形成的类胚体表面抗原检测Nanog和SSEA-1呈阳性。自分化检测三胚层分化标记基因SOX17、SMA和TUJ-1呈阳性。核型分析显示,悬滴培养形成的类胚体具有并保持正常的核型。鸡ESCs悬滴培养形成类胚体的适宜细胞浓度为3×104 mL-1,且形成的类胚体可分化成3个胚层,用于体外定向诱导过程。本研究建立了鸡ESCs体外悬滴培养形成类胚体的培养体系,为后期信号通路的体外验证提供试验基础。

小鼠DAZL基因启动子核心区域分析及甲基化对其启动活性的影响

旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制。采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到p EGFP-N1和p GL3-Basic载体,构建重组载体。将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化。双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370^-36 bp,在-370^-166 bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性与对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著。本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考。

如皋黄鸡功能未知基因C1EIP表达载体的构建及其抗小鼠血清制备

为了深入研究鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向雄性生殖细胞分化过程,基于RNA-Seq基础,筛选出功能未知且差异极其显著的关键基因C1EIP,PCR克隆得到其编码区全长序列409bp,构建其真核表达载体pcDNA3.0-C1EIP和pEGFP-C1EIP,实现C1EIP在真核细胞内的定位表达,并以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP后免疫小鼠制备抗血清。间接免疫荧光检测抗血清效价为1∶10,RT-PCR和Western blot证实C1EIP真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,为C1EIP基因在ESCs向雄性生殖细胞分化过程中的功能研究奠定了基础。

如皋黄鸡新基因LBC多抗的制备及其亚细胞定位

克隆如皋黄鸡LBC(Libichun)基因CDS区,通过GFP-LBC融合蛋白和间接免疫荧光法(IFA)来实现该基因的亚细胞定位,为其基因功能研究奠定基础。提取如皋黄鸡18日龄的鸡胚睾丸RNA,巢式PCR方法扩增LBC基因的CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N1-LBC转染DF-1细胞,48h后观察其绿色荧光表达情况,同时制备LBC基因的多克隆抗体,利用IFA标记LBC基因的表达部位。本研究成功克隆出如皋黄鸡LBC基因的完整编码区,成功制备抗体和构建pEGFP-N1-LBC、pcDNA3.0-LBC。GFP-LBC融合蛋白和IFA的结果显示,如皋黄鸡LBC基因在细胞质和细胞核中都有表达,为下一步LBC基因的功能研究奠定了基础。