盖塔病毒SC483株cDNA感染性克隆的构建

【背景】盖塔病毒(Getah virus,GETV)是一种由蚊虫传播的病毒,分类学上属于披膜病毒科甲病毒属成员。该病毒宿主范围广,可感染猪、马、牛、狐狸等多种哺乳动物,人也可以感染,但在人群中造成的危害尚不知晓。动物感染主要临床表现为发热、皮疹、关节炎、繁殖障碍和死胎。GETV在世界范围内流行较为广泛,近年来在我国的流行呈上升趋势,2018年我国南方多个猪场爆发该病,GETV在畜禽养殖及公共卫生方面的危害渐渐受到人们的关注。目前,尚无用于预防和治疗盖塔病毒感染的商业化疫苗和药物。由于对GETV研究较少,其生物学特性、对不同物种的致病性和致病机制以及流行趋势在很大程度上均是未知的。【目的】建立高效的GETV反向遗传操作平台,为深入研究GETV基因组结构与功能、致病机制以及开发新型疫苗奠定基础。【方法】采取化学合成的方式人工合成了两端分别含有锤头状核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)序列的GETV SC483株基因组全长,并克隆至低拷贝pOK12-CMV载体中,从而获得含有GETV SC483株基因组全长cDNA克隆的重组质粒pGETV-SC483。将纯化的重组质粒pGETV-SC483转染BHK-21细胞进行病毒拯救。对拯救病毒进行连续传代、鉴定以及生物学特性分析,并对感染性克隆质粒pGETV-SC483在大肠杆菌中的遗传稳定性进行验证。【结果】重组质粒pGETV-SC483转染BHK-21细胞后,48 h即可观察到GETV感染引起的典型细胞病变,获得的拯救病毒命名为rSC483。分别提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA,对病毒基因组进行RT-PCR扩增、Not I酶切以及序列测定。结果表明,拯救病毒不同于亲本病毒,其含有人为引入以消去Not I酶切位点的G4332A突变的分子标记。使用GETV特异性抗体作为检测抗体的间接免疫荧光试验和病毒粒子形态学电镜负染观察结果进一步表明,GETV拯救成功。噬斑形成试验和一步生长曲线试验结果表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的复制能力和增殖特性。另外,感染性克隆质粒pGETV-SC483在大肠杆菌DH5α中连续传代后的测序结果表明,该重组质粒具有良好的遗传稳定性。【结论】成功构建了稳定、高效的GETV SC483株全长cDNA感染性克隆,为GETV生物学特性及致病机理研究以及新型疫苗开发提供了技术平台。