新疆部分地区马疱疹病毒1型感染的血清学调查

旨在了解新疆地区马疱疹病毒1型感染的流行现状和特点,本研究于2019—2020年从新疆乌鲁木齐、昌吉州、伊犁州、巴州16处规模化马场收集1657份马血清样品,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行抗体检测,对不同地区、品种、性别及年龄马匹的马疱疹病毒1型抗体阳性率进行统计分析。结果显示,乌鲁木齐、伊犁州、昌吉州、巴州马疱疹病毒1型抗体阳性率分别为39.34%、22.56%、90.52%、5.00%;纯血马、混血马、哈萨克马、伊犁马、焉耆马、普氏野马的EHV-1抗体阳性率分别为20.34%、32.93%、44.92%、19.35%、5.00%、90.52%;普氏野马与家马的EHV-1抗体阳性率分别为90.52%和29.32%;家马中新疆本土品种马与引进品种马的EHV-1抗体阳性率分别为31.70%和25.50%;母马与公马的EHV-1抗体阳性率分别为38.84%和22.00%;处于幼年、青年、成年、老年阶段的马匹EHV-1抗体阳性率分别为35.37%、33.00%、34.31%、23.81%。结果提示,新疆乌鲁木齐、伊犁州、昌吉州、巴州规模化养殖场普遍存在EHV-1感染,且不同地区、品种、性别及年龄的马EHV-1感染率差异显著(P<0.05)。本研究为新疆地区EHV-1感染的探讨和防控工作提供调查数据。

马疱疹病毒1型感染马疾病模型的建立及评价

试验旨在建立马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus type1,EHV-1)人工发病模型,确定EHV-1感染马的半数感染量(ID_(50))及感染发病的判定标准,为该病的预防与治疗药物的研发奠定基础。以新疆伊犁地区某发病马场流产胎儿中分离的EHV-1 XJ2015株为研究对象,设立4组不同病毒剂量感染组及对照组,经鼻内喷雾感染马,5 mL/匹,每天观察试验马的临床症状和发病情况,14 d后进行剖检,观察各组织脏器病理变化并应用实时荧光定量PCR方法检测鼻腔排毒及病毒分布情况。结果显示,EHV-1 XJ2015株感染马的ID_(50)为10^(-6.67)/5 mL,其病毒含量为104.33 TCID_(50)/mL。与对照组相比,1×10^(6)和1×10^(5)TCID_(50)/mL感染组马临床评分显著升高,主要表现为体温升高(高达39.5℃,一般持续2~6 d)、食欲不振、流浆液性鼻液和下颌淋巴结肿大;且1×10^(6)和1×10^(5)TCID_(50)/mL感染组试验马均表现出不同程度的排毒,肺脏及脑组织中可检测出大量病毒,与对照组相比极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05);病理学检查发现,患马脑组织出现非化脓性脑炎及神经元水肿,肺脏组织出现间质性肺炎、嗜中性粒细胞、炎性细胞浸润、出血和肺泡间隔增厚。以上结果表明,EHV-1 XJ2015株对马具有较强的致病性,患病马临床症状典型,病毒主要随鼻液排出,并富集在肺脏及脑组织,通过上述指标确定EHV-1感染马发病的判定标准,本试验成功建立EHV-1感染本体动物疾病模型。

新疆乌鲁木齐地区马疱疹病毒1型、马动脉炎病毒、马流感病毒感染的血清学调查

为了解新疆乌鲁木齐地区马疱疹病毒1型(EHV-1)、马动脉炎病毒(EAV)、马流感病毒(EIV)的感染现状和特点,本研究采集该地区676份马血清样品,分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和血凝抑制试验(HI)进行上述病毒的血清抗体的检测,采用统计学方法分析不同地区、年龄、性别及品种马的EHV-1、EAV、EIV的抗体阳性率。结果显示,新疆乌鲁木齐地区马群EHV-1、EAV、EIV及EHV-1+EIV抗体阳性率分别为39.35%(266/676)、0(0/676)、40.53%(274/676)、24.85%(168/676)。其中,南山景区、乌鲁木齐县、达坂城区马群感染EHV-1的抗体阳性率分别为44.44%(72/162)、57.89%(88/152)、66.67%(52/78),显著高于新市区16.00%(32/200)和米东区26.19%(22/84)(p<0.05);米东区、南山景区、乌鲁木齐县、达坂城区马群感染EIV的抗体阳性率分别为58.00%(58/84)、57.00%(57/162)、47.37%(95/152)、41.03%(32/78),显著高于新市区16.00%(32/200)(p<0.05);1岁以内马驹EHV-1、EIV及EHV-1+EIV抗体阳性率最高,分别为50.00%(20/40)、77.50%(31/40)、32.50%(13/40),显著高于其它年龄的马(p<0.05)。10岁以上马EHV-1、EIV及EHV-1+EIV抗体阳性率最低,分别为26.05%(31/119)、33.61%(40/119)、14.29%(17/119);母马感染EHV-1、EIV的抗体阳性率分别为54.21%(58/107)、67.29%(72/107),显著高于公马36.56%(208/569)、35.50%(202/569)(p<0.05);本地品种哈萨克马EHV-1、EIV及EHV-1+EIV抗体阳性率最高,分别为54.95%(200/364)、54.67%(199/364)、35.71%(130/364),显著高于其他品种的马(p<0.05)。除混血马外,其它品种的马均存在不同程度的EIV感染;伊犁马EIV和EHV-1+EIV抗体阳性率最低,均为9.09%(2/22),显著低于其它品种的马(p<0.05);不同地区、年龄、性别及品种的马EHV-1、EIV感染率差异显著(p<0.05)。本研究为该地区这3种马传染病的研究和防控提供数据参考。

马疱疹病毒1型gG蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为了解新疆马疱疹病毒1型(EHV-1)的流行情况,需要建立一种检测抗体的间接ELISA方法。采用纯化后EHV-1 XJ2015株的gG蛋白作为检测抗原,优化反应条件后建立检测EHV-1血清抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验及商品化试剂盒的应用效果对比。结果表明,该方法仅与EHV-1阳性血清发生反应,不与马疱疹病毒4型、马流感病毒和马动脉炎病毒阳性血清发生反应,血清稀释1∶1600后,仍可以检测到阳性,组内及组间变异系数均小于5%。与试剂盒进行检测结果比较,符合率为93.35%。建立了EHV-1 gG蛋白间接ELISA检测方法,可为EHV-1的快速诊断、流行病学调查及防控工作提供技术支撑。

马MHC-I-B_(2)蛋白对马疱疹病毒1型胞内复制影响的研究

为探明马MHC-I-B_(2)蛋白对马疱疹病毒1型(EHV-1)胞内复制的影响,本研究合成马MHC-I-B_(2)基因,并将其克隆至慢病毒表达载体,构建重组质粒pLVML-HA-MHC-IRES-Puro。利用慢病毒载体系统将pSPAX2、pMAD.2G、pLVML-HA-MHC-IRES-Puro共转染HEK-293T细胞,同时共转染pLenti-GFP-N2,pSPAX2和pMAD.2G质粒作为对照组,待对照组细胞出现绿色荧光时收获各组感染后的BHK-21细胞获得相应慢病毒。将上述慢病毒感染BHK-21细胞并经嘌呤霉素筛选后将获得表达马MHC-I-B_(2)的细胞并传20代,分别取第5、10、15、20代细胞,通过PCR检测马MHC-I-B_(2)的重链基因序列,分析构建细胞系的遗传稳定性,并利用western blot检测第20代细胞中马MHC-I-B_(2)重链基因的表达。结果显示,正确构建了稳定过表达马MHC-I-B_(2)蛋白的BHK-21细胞系(BHK-21-Equus MHC-I-B_(2))。采用EHV-1(MOI 0.1)感染BHK-21-Equus MHC-I-B2与其亲本细胞BHK-21,检测病毒滴度,结果显示BHK-21-Equus MHC-I-B_(2)细胞病变效应(CPE)更明显,病毒滴度比其亲本细胞提高了3.2~4.4倍,可见马MHC-I-B_(2)蛋白可显著提高EHV-1的增殖水平。本研究建立了稳定过表达马MHC-I-B_(2)蛋白的BHK-21细胞系,并首次证实马MHC-I-B_(2)蛋白对EHV-1的增殖具有促进作用,为今后EHV-1的感染机制研究奠定物质基础。

马疱疹病毒1型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确地检测马疱疹病毒1型(equine herpesvirus 1,EHV-1),本研究根据EHV-1基因组序列进化分析筛选出特异性较高的ORF68基因的保守区域设计引物与探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该方法线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,最低检测量为10.2拷贝/μL,比常规PCR敏感1000倍;特异性强,检测EHV-2、EHV-4、EHV-5、马动脉炎病毒和马流感病毒均无交叉反应;重复性好,组内及组间样本检测的Ct值均小于等于2%;对2020年收集的60份伴有呼吸道症状的马匹鼻试子进行检测分析显示本方法的阳性检出率(26.67%)高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR(23.33%)和常规PCR(21.67%)。本研究建立了一种快速、灵敏、稳定、特异性强的TaqMan荧光定量PCR检测方法,可用于EHV-1的快速诊断和核酸定量检测,为EHV-1的防控工作提供了有力手段。

马疱疹病毒1型gp2基因缺失株的构建及生长特性分析

构建针对马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1,EHV-1)XJ2015株的转移载体pUC-gp2^(-)LR和pUC-gp2^(-)LR-EGFP;将EHV-1 XJ2015基因组与pUC-gp2^(-)LR-EGFP共转染至RK-13细胞,利用EGFP基因筛选获得EHV-1 XJ2015-gp2^(-)/EGFP+毒株,以此毒株基因组与pUC-gp2^(-)LR共转染至RK-13细胞,筛选去除EGFP基因的EHV-1 XJ2015-gp2^(-)毒株并通过生长曲线、蚀斑形态、易感细胞连续传代评价其增殖能力和遗传稳定性。结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,获得能稳定遗传的EHV-1 XJ2015-gp2^(-),该毒株的生长曲线与亲本株存在差异,增殖能力下降约2个病毒滴度;两者的空斑面积平均值分别为0.378 mm^(2)和1.698 mm^(2),差异极显著(P<0.01)。结果表明,成功获得EHV-1 gp2基因缺失株,该毒株的体外生长动力学较亲本毒弱,为研制EHV-1减毒活疫苗奠定了基础。

马疱疹病毒1型XJ2015株的增殖、纯化及鉴定

目的评价蔗糖密度梯度离心法对马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1,EHV-1)XJ2015株的纯化效果。方法病毒增殖后,收获病毒液,经硫酸铵浓缩、蔗糖密度梯度离心法纯化EHV-1,电镜下观察病毒形态,SDS-PAGE、Western blot、BCA及马体致病性试验鉴定病毒纯化效果。结果纯化后的EHV-1电镜下可见完整的病毒颗粒且形态典型,直径约120 nm,效价可达10^(10.02) TCID_(50)/0.1 mL,回收率为61.7%;SDS-PAGE及Western blot分析显示,纯化病毒杂蛋白显著减少且具有良好的反应原性;纯化后病毒感染马匹出现原发性感染临床症状并出现排毒现象。结论利用蔗糖密度梯度离心法可获得高纯度的纯化病毒株EHV-1-XJ-2015,为进一步研究EHV-1的致病机理及减毒、灭活疫苗的研发提供了参考。

EHV-1-XJ2015株在不同细胞系中增殖规律研究

为了研究马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus 1,EHV-1)在不同细胞系中的增殖规律,试验将该病毒分别接种至Vero细胞、BHK-21细胞和MDBK细胞中进行连续传代培养,观察细胞病变(CPE)情况;对第3代收获的病毒gE基因进行PCR检测及同源性比对;按照Reed-Meunch方法分别测量3种细胞7个时间点的TCID_(50),并绘制一步生长曲线。结果表明:EHV-1对3种细胞有很好的亲嗜性,产生明显CPE;3种细胞都扩增出大小为438 bp的片段,与所选的参考株同源性在99.99%以上;EHV-1在感染3种细胞后0~12 h进入静止期,12~48 h进入快速增长期;感染BHK-21细胞后在36小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)为1×10^(-8.40)/0.1 mL,感染MDBK细胞及Vero细胞后在48小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)分别为1×10^(-7.35)/0.1 mL和1×10^(-5.80)/0.1 mL。说明BHK-21细胞适合作为EHV-1-XJ2015株体外研究的细胞系。