E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1对布鲁氏菌诱导细胞凋亡的影响

为了探讨E3泛素连接酶Nrdp1、SOCS-1基因在布鲁氏菌侵染巨噬细胞过程中对细胞凋亡的影响,构建Nrdp1、SOCS-1基因的干扰和过表达细胞模型(简称为pLL3.7-N1、pLL3.7-S1和pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1);羊种布鲁氏菌16M(简称16M)侵染正常细胞RAW264.7及pLL3.7-N1、pLEX-Nrdp1、pLL3.7-S1、pLEX-SOCS-1组细胞,qRT-PCR检测Bax、Bcl-2、TNF-α的mRNA表达量,并通过流式细胞仪术检测细胞凋亡率。结果显示,试验成功构建并筛选出干扰和过表达Nrdp1、SOCS-1效果最好的pLL3.7-N1、pLEX-Nrdp1、pLL3.7-S1、pLEXSOCS-1细胞模型;16M侵染各组细胞,与对照组相比,在不同的时间段pLL3.7-N1、pLL3.7-S1、pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1组细胞的Bcl-2和Bax的mRNA表达量差异显著(P<0.05);pLL3.7-S1组细胞的TNF-αmRNA显著降低(P<0.05),而pLEX-SOCS-1组显著升高(P<0.05);pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),而pLL3.7-S1组显著降低(P<0.05)。研究结果表明,Nrdp1、SOCS-1基因与16M诱导的细胞凋亡密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。

ApoBR在布鲁氏菌侵染过程中对细胞凋亡影响的研究

目的探讨载脂蛋白B受体基因ApoBR在布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7所引起的细胞凋亡的影响。方法构建、筛选干扰ApoBR基因的慢病毒干扰载体,并干扰小鼠巨噬细胞ApoBR的表达;以牛种布鲁氏菌2308株侵染巨噬细胞,分别在侵染后4、8、12和24h收集细胞和上清液,采用实时荧光定量PCR和ELISA法检测ApoBR基因、肿瘤坏死因子TNF-α以及凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达水平;做胞内菌的CFU计数,利用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果慢病毒转染后pLentiLox-253和pLentiLox-1325组ApoBR mRNA细胞抑制率分别为53.3%和57.4%;TNF-α表达水平较对照组升高(P<0.05);CFU计数显示,细菌侵染后8h,巨噬细胞凋亡抑制率达到最高,253实验组抑制率为71.7%,1325实验组抑制率为67.0%;在不同时间点促凋亡基因Bax表达水平上调,而抑制凋亡基因Bcl-2表达水平下调。结论载脂蛋白B受体蛋白在布鲁氏菌早期感染引起的细胞凋亡过程中起到减缓细胞凋亡的作用,为进一步研究布鲁氏菌在巨噬细胞内的分子机制奠定了基础,也为寻找治疗布鲁氏菌的有效药物和疫苗提供了理论依据。

AIR在羊种布鲁氏菌16M诱导的非典型自噬中的研究

目的探讨膜融合相关蛋白TECPR1对羊种布鲁氏菌16M感染小鼠巨噬细胞RAW264.7(RAW264.7)引起的非典型自噬及布鲁氏菌胞内生存繁殖能力的影响。方法根据AIR核苷酸序列,分别设计2条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到慢病毒pLentiLox3.7载体,并转染RAW264.7,通过QRT-PCR筛选干扰效果最优的质粒;用布鲁氏菌感染干扰AIR后的RAW264.7,采用QRT-PCR检测细胞自噬相关基因p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的mRNA表达量,采用Western blot检测细胞自噬相关基因p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达量;同时检测16M在干扰AIR后RAW264.7中的生存繁殖能力。结果获得2条对AIR干扰效果达70%以上特异性的siRNA分子,自噬相关基因LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62的mRNA相对表达量分别为66%、77%和63%,差异有统计学意义(F值分别为21.52,25.38,10.87,P<0.05);LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62蛋白相对表达量分别为45.71%、34.29%和46.13%,差异有统计学意义(F值分别是753.92,332.38,768.15,P<0.01);24h后干扰AIR后的RAW264.7中布鲁氏菌数量为8.58×105CFU,对照组为6.02×106 CFU,差异有统计学意义(F值为13.45,P<0.05)。结论 AIR基因沉默可促进布鲁氏菌诱导的非典型自噬进一步成熟,布鲁氏菌胞内繁殖力显著降低,这可能是AIR结构域在自噬小体和溶酶体融合过程中发挥重要作用,该研究进一步解释了布鲁氏菌能够逃避巨噬细胞自噬-溶酶体降解途径的分子机制。

新疆北疆部分地区硬蜱伯氏疏螺旋体基因型研究

目的调查和鉴定新疆北疆石河子市、沙湾县、伊宁县和察布查尔县媒介蜱，并确定其携带的莱姆病螺旋体的基因型。方法选择4县市6个牧区为调查点，采集羊源寄生硬蜱，结合形态学与16SrRNA进行蜱种鉴定；采用BSK．H培养基对莱姆病螺旋体分离培养，并用硝酸银染色和巢式PCR法进行病原检测，阳性产物测序结果比对，并与11种GenBank参考序列比对，确定莱姆病螺旋体的基因型。结果6个调查点共采集寄生硬蜱900多只，经形态学与16SrRNA鉴定分别为网兰扇头蜱、刻点血蜱、亚洲璃眼蜱和边缘革蜱；从中分别选取样本硬蜱共102只，分24管，分离培养后结合巢式PCR和硝酸银染色共获得16管阳性培养物。5S～23SrRNA基因间隔区测序比对分析表明，所有菌株为伯氏疏螺旋体与国际报道的B．burgdoferi Sensu Stricto（B31）基因型具有高度同源性，同源性为98．6％～99．5％；OspC基因型分析与上述结果一致。结论4县市分离获得伯氏疏螺旋体，基因型为B．burgdorferi Sensu Stricto，且存在生物多样性。从图兰扇头蜱中分离到伯氏疏螺旋体为我国首次报道。