B群链球菌及其大环内酯类耐药基因LAMP快速可视化检测方法的建立和初步应用

目的建立一种快速可视化检测B群链球菌(GBS)及其大环内酯类耐药基因的环介导恒温扩增(LAMP)方法,为临床GBS检测提供新方法。方法针对GBS特异性基因cfb和大环内酯类耐药基因ermB、mefA/E和linB设计LAMP反应的引物;建立并优化LAMP的反应体系和反应条件,反应结果通过DNA扩增曲线和肉眼观察反应液颜色变化判断;以携带上述基因的质粒DNA为检测标准,确定LAMP方法检测目标基因的敏感性与特异性,并与PCR方法的检测结果比较;采用LAMP方法检测临床300份孕产妇阴道直肠拭子标本中GBS,与分离培养法的检出率进行统计学分析;采用LAMP方法检测80株GBS临床分离株中大环内酯类耐药基因,并与药敏试验结果进行统计学分析。结果建立了快速可视化检测GBS及其大环内酯类耐药基因的LAMP反应体系和方法,该法在63℃、45 min内完成;该法能够特异性检测pMD-cfb、pMD-ermB、pMD-mefA/E、pMD-linB质粒DNA,其灵敏度为10-5 ng/μL,是PCR方法灵敏度的100倍;对300份孕产妇阴道直肠拭子标本进行检测,LAMP方法对GBS检出率为12.7%,分离培养检出率为11.3%,两者没有统计学差异(P>0.05);药敏试验和LAMP方法检测80株GBS中大环内酯类耐药菌株的检出率分别为53.8%和48.8%,二者没有统计学差异(P>0.05)。结论本研究建立的GBS及其大环内酯类耐药基因LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视等优点,对临床新生儿GBS疾病的预防和治疗具有重要意义。

槲皮素对人牙龈间充质干细胞功能的影响

目的研究槲皮素对人牙龈间充质干细胞(GMSCs)的细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、表面标志物表达和成骨分化能力的影响。方法以不使用槲皮素处理GMSCs为对照组, CCK-8法检测2.5、5、10、20 μmol/L槲皮素对GMSCs细胞增殖的影响。10 μmol/L、20 μmol/L槲皮素处理GMSCs细胞96 h后, 流式细胞术检测细胞凋亡及表面标志物的表达, 免疫印迹法检测GMSCs细胞Cleaved PARP、p-BCL-2、Bax和Cleaved Caspase 3蛋白表达。10 μmol/L槲皮素处理4周后, 茜素红染色检测槲皮素对GMSCs成骨分化能力的影响。结果与对照组相比, 不同浓度的槲皮素干预GMSCs后细胞存活率明显下降;2.5、5、10、20 μmol/L槲皮素处理96 h后GMSCs的存活率分别为78.93%、66.81%、56.35%、39.22%(P<0.05)。不同浓度槲皮素处理96 h后流式细胞术检测显示GMSCs的早期凋亡和晚期凋亡细胞数量均明显增加, 对照组、10 μmol/L槲皮素组、20 μmol/L槲皮素组的细胞凋亡率分别为8.30%、17.88%、20.77%(P<0.05);免疫印迹法检测显示, 与对照组比较, 10 μmol/L槲皮素组和20 μmol/L槲皮素组GMSCs的促凋亡蛋白Cleaved PARP、Bax和Cleaved Caspase 3表达增加, 抑制凋亡蛋白p-BCL-2表达减少(均P<0.05);流式细胞术检测显示, 与对照组相比, 10 μmol/L槲皮素干预GMSCs后CD90阳性率从88.4%降低至15.3%;20 μmol/L槲皮素干预GMSCs后CD45阳性率从3.18%上升至9.77%, CD34阳性率从1.08%上升至5.70%(均P<0.05)。茜素红染色显示, 10 μmol/L槲皮素组处理4周后GMSCs未见矿化结节形成。结论槲皮素能显著抑制GMSCs细胞功能, 提示在进行GMSCs培养或者治疗时应避免槲皮素等黄酮类物质的干扰作用。

卡介苗促进肺间充质干细胞IL-10和TGF-β1表达

目的研究卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)对肺间充质干细胞(lung-resident mesenchymal stem cells, LR-MSCs)增殖、细胞凋亡、细胞因子及相关蛋白表达,探讨LR-MSCs在结核病(tuberculosis, TB)发生、发展中的作用。方法采用CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡及表面蛋白(CD45、CD19、CD34、CD14、CD90、CD105、CD29、CD44和CD73)、ELISA检测IL-10含量、Western Blot检测相关蛋白表达(STAT3、p-STAT3和TGF-β1)。结果 BCG对LR-MSCs细胞增殖(P=0.530,P>0.05)、凋亡(P=0.650,P>0.05)、表面标志物表达和相关蛋白STAT3表达均无显著影响(P>0.05);BCG促进LR-MSCs细胞IL-10产生(P<0.05)、TGF-β1和p-STAT3表达(P<0.05)。结论 BCG感染可能通过促进LR-MSCs细胞IL-10和TGF-β1表达,激活STAT3磷酸化,从而影响TB的发生、发展。