心肌细胞面积与其活力缺乏相关关系

目的 :建立培养心肌细胞活力的测定与简便的面积测量方法 ,观测不同培养条件下 ,新生大鼠心肌细胞面积与活力的关系 .方法 :采用一步伊红染色法与NIHImage软件测量心肌细胞面积 .MTT比色法测量心肌细胞的A490nm 值 ,以A490nm/总细胞数之比作为衡量心肌细胞活力的指标 .结果 :心肌细胞面积随培养时间延长而增大 ,随接种密度增加而减小 ,且有血清培养组的面积明显大于无血清培养组 (P <0 .0 1 ) .心肌细胞的A490nm值与A490nm/总细胞数之比随培养时间延长均保持不变 ,当细胞接种密度为 4 .5× 1 0 4/cm2 时 ,A490nm/总细胞数之比达峰值 ,且无血清培养组的A490nm值与A490nm/总细胞数之比皆明显低于有血清组 (P <0 .0 1 ) .结论 :在培养时间与细胞接种密度不同的培养条件下 ,培养新生大鼠心肌细胞面积的改变并未对其活力产生明显影响 。

铅暴露对生长发育期大鼠肝、肾功能及血液学指标的损伤作用研究

目的通过检测铅中毒大鼠肝、肾功能及部分血液学指标,阐明铅暴露对发育期大鼠肝、肾功能及血液学指标的损伤作用,为铅中毒的毒性效应研究以及防治提供实验依据。方法大鼠醋酸铅饮水染毒建立模型,通过模型肝、肾功能及血液学指标的改变,探讨铅暴露对大鼠肝、肾功能的损伤作用。结果染铅大鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)水平较对照组显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);血清胆碱酯酶(CHE)水平较对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示肝细胞损伤;染铅大鼠血清尿素氮(BUN)、胱抑素C(CYS-C)水平较对照组显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),提示肾小球率过滤及肾功能损伤;铅暴露大鼠红细胞、血红蛋白、血小板数量下降显著,差异有统计学意义(P<0.05),提示贫血及凝血机制障碍。结论慢性铅暴露可以引起生长发育期大鼠的肝、肾功能损伤及贫血的发生。

铅诱导血脑屏障体外模型中紧密连接相关蛋白的信号调控

目的研究铅损伤体外血脑屏障(BBB)模型的紧密连接过程中,MAPK、AKT通路的改变,并观察相关通路的抑制剂的调节作用。方法利用TranswellTM小室培养系统将ECV304人脐静脉内皮细胞系与C6大鼠胶质瘤细胞共培养建立体外BBB模型。共培养实验组按照加入醋酸铅(PbC4H6O4)浓度的不同分组。测量跨内皮阻抗(TEER)和FITC-葡聚糖通过量,以动态TEER峰值和FITC-葡聚糖通过量作为判断ECV304细胞紧密连接形成的标准。Western blot法检测铅暴露对细胞紧密连接相关蛋白表达的影响;利用免疫荧光细胞化学染色检测紧密连接相关蛋白的细胞定位;染铅细胞MAPK、PI3K/AKT通路抑制作用。结果铅对ECV304细胞的生长具有抑制作用,且具有时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05);随着培养时间延长,TEER的测定值不断下降,而FITC-葡聚糖通过量显著上升(P<0.05);Western blot法检测发现,在2.5μmol/L铅作用条件下,ECV304细胞和C6细胞共培养体系中ECV304细胞中的紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达水平逐渐下降;p38、ERK、AKT的磷酸化水平逐渐增强;采用免疫荧光细胞化学染色发现ECV304细胞紧密连接相关蛋白表达减弱,信号通路抑制剂抑制铅诱导的信号通路活化,ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY2940021可抑制铅诱导的紧密连接相关蛋白表达降低。结论铅可诱导BBB通透性增强,MAPK、AKT通路抑制剂可抑制BBB通透性。

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达.方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞;RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达.结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中.结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.

ndrg2基因2种亚型重组腺病毒载体的构建

目的:构建表达N-myc下游调节基因2(ndrg2)2种亚型的重组腺病毒载体,为与ndrg2相关肿瘤的基因治疗奠定基础.方法:采用腺病毒表达系统ViraPowerTM Adenoviral Expression System构建腺病毒载体.首先将ndrg22种亚型(长短2种亚型分别命名为ndrg2L,ndrg2S)利用酶切、连接、转化、扩增后提取质粒等方法克隆入入门载体pENTR2B以获得入门克隆pENTR2B-NDRG2L和pENTR2B-NDRG2S,经双酶切及PCR鉴定正确后,用重组酶LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix进行入门克隆与表达载体pAd-CMV/V5-DEST间的重组反应,以获得表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L和pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2S的质粒.表达克隆经PCR鉴定后用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒(分别命名为Ad-NDRG2L和Ad-NDRG2S),经过反复的感染扩增后,用半数组织培养感染剂量法(TCID50)检测病毒滴度,用Western Blot法检测重组病毒载体是否能正确表达NDRG2蛋白.结果:证实入门克隆pENTR2B-NDRG2L/S和表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L/S经酶切鉴定和PCR鉴定质粒构建正确,转染HEK293A细胞并反复扩增后获得的病毒滴度分别为:Ad-NDRG2L,4.0×1012空斑形成单位(PFU)/L;Ad-NDRG2S,6.3×1012PFU/L.且这2个病毒能正确表达NDRG2蛋白.结论:成功构建了ndrg2基因长短2种亚型的重组腺病毒载体,并包装扩增病毒,可为肿瘤基因治疗的研究提供依据.

丹黄通脉方对大鼠颈动脉粥样硬化性狭窄模型炎性反应的影响

目的研究丹黄通脉方(DHTMD)对大鼠颈动脉粥样硬化性狭窄模型炎性反应的影响。方法将大鼠随机分为四组,每组10只。三组采用高脂加高蛋氨酸复合饲料喂养4 W后行颈总动脉球囊拉伤术法制备大鼠颈动脉狭窄模型,空白组给予普通饲料喂养,其余三组给予高脂加高蛋氨酸复合饲料喂养,阳性药组给予辛伐他汀2.5 mg/kg,DHTMD组给予DHTMD 20 g/kg生药量,配制成10 mL/kg的药液,灌胃给药,一天两次。继续喂养8 W后,检测血脂四项、TNF-α、CRP、ICAM-1及Hcy的水平。结果与空白组比较,4W时其它三组大鼠的TC和Hcy明显升高(P<0.05);治疗8 W后与模型组比较,DHTMD组和阳性药组的Hcy、CRP、TNF-α、ICAM-1、TC、TG、LDL-C水平均有显著降低(P<0.05);与阳性药组比较,DHTMD组的Hcy、CRP、TNF-α、ICAM-1及LDL-C水平降低且有统计学意义(P<0.05)。结论 DHTMD具有调节血脂代谢和抗炎作用,能够抑制颈动脉粥样硬化的形成,防治缺血性脑血管疾病。

人DDR2基因pShuttle-CMV穿梭载体的构建及表达

目的:构建带有flag标签的人DDR2 pShuttle-CMV载体,检测其真核表达并观察DDR2分子的亚细胞分布.方法:以含有人全长DDR2cDNA的质粒为模板,用PCR方法扩增DDR2基因的C-端(DDR2-C),并在其C末端带上含24bp的flag标签,NcoI/EcoRV酶切后亚克隆入含有DDR2全长序列的pMD18-T载体,即替换掉原有DDR2序列的C-端,引入flag标签,测序正确后再克隆入pShuttle-CMV表达载体,酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染HEK293细胞,West-ern Blot检测DDR2-flag在细胞中的表达.瞬时转染Hela细胞,通过间接免疫荧光法观察DDR2分子在细胞内的分布情况.结果:测序及酶切显示DDR2-flag/pShuttle-CMV载体构建符合预期;脂质体法转染HEK293细胞,24h后用Western Blot方法检测到目的蛋白的表达;对转染了目的载体的细胞应用FITC标记的抗体进行间接免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜观察到DDR2分子主要分布于细胞质与细胞膜.结论:成功构建并表达了C-末端带flag标签的DDR2真核表达载体,使其在真核细胞中表达,并观察到其亚细胞分布.

RNA干扰现象研究获诺贝尔奖的启示

RNA干扰现象是目前生命科学领域的研究热点。由于RNA干扰具有十分重要的理论和应用价值,因此该现象在揭示后仅8年其研究者就获得了诺贝尔生理与医学奖。通过回顾RNA干扰现象的发现历程,可以为今后的科研探索过程提供许多有益的启示。

思密达配伍小儿止泻散治疗迁延性腹泻

目的 寻找针对小儿迁延性腹泻的治疗方法。方法 选择 1994年 1月 - 2 0 0 1年 1月 0 - 7岁门诊及住院部就诊符合诊断标准的 137例。随机分组 ,治疗组 10 2例予思密达配伍小儿止泻散治疗 ,对照组 35例行双向对照观察。结果 对照组 35例总有效率 6 5 .71% ,治疗组 10 2例总有效率 91.18% ,治疗组明显优于对照组 ,且疗程缩短 ,一般营养、代谢情况改善。两者比较有统计学意义。结论 小儿止泻散与思密达伍用治疗小儿迁延性腹泻较单用思密达疗效显著 ,值得临床推广。

干涉HOTAIR对HepG2肝癌细胞增殖和周期的影响

目的探讨干涉HOX转录物反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)对HepG2肝癌细胞增殖和周期的影响。方法以人正常肝细胞系Chang liver为对照,采用RT-PCR分析HepG2、SMMC-7721、Bel-7402和MHCC97肝癌细胞中HOTAIR的表达水平,以HOTAIR表达显著增高的肝癌细胞系为模型,分两组进行实验,阴性对照组(NC组)转染阴性对照siRNA,干涉HOTAIR组(siHOTAIR组)分别转染3种siHOTAIR(siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3),通过RT-PCR确定干涉效果最显著的siHOTAIR,然后MTT检测细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的改变。结果与Chang liver相比,HepG2、SMMC-7721、Bel-7402和MHCC97细胞中HOTAIR的表达均增高,以HepG2增高最显著(P<0.01)。与NC组比较,siHOTAIR组中siRNA#2的干涉效果最明显(P<0.01),且siHOTAIR组(siRNA#2)HepG2细胞增殖能力显著降低,并发生G1期阻滞(P<0.01)。结论干涉HOTAIR能够抑制HepG2细胞增殖并诱导G1期阻滞。

三维激光扫描技术在异型建筑物施工轴线检测中的应用

针对常规测绘手段采集异型建筑物特征效率低、表达不完整的缺点,以南通某幢高层异型建筑物为例,采用三维激光扫描仪作为施工轴线检测数据采集设备,通过控制点布设、点云外业采集及点云内业处理对异型建筑物进行了施工轴线检测,并对其精度进行了评估,验证了三维激光扫描技术应用于异型建筑物施工轴线检测的可行性。

复合营养素对寒冷暴露大鼠骨骼肌功能的保护作用

目的观察复合营养素对寒冷暴露大鼠骨骼肌功能的保护作用。方法雄性SD大鼠32只,按体重随机平均分为饮用水灌胃室温对照组(n=8)、复合营养素灌胃室温对照组(n=8)、饮用水灌胃寒冷暴露组(n=8)和复合营养素灌胃寒冷暴露组(n=8)。灌胃3周后进行急性寒冷暴露,暴露温度-15℃,时间6h。观察每组大鼠骨骼肌细胞ATP含量变化及细胞超微结构的改变。结果①寒冷暴露使大鼠骨骼肌细胞ATP含量下降(1.353±0.873μmol/L),明显低于室温对照组(6.594±0.421μmol/L)(P<0.01),电镜结果显示:细胞线粒体肿胀、易位,肌浆网肿胀,Z线紊乱。②复合营养素可以明显增加寒冷暴露大鼠骨骼肌细胞ATP含量(5.887±0.385μmol/L),与室温对照组(6.594±0.421μmol/L)相比差异无统计学意义(P>0.05),电镜结果显示:骨骼肌细胞超微结构正常,线粒体形态完整、排列整齐。结论复合营养素对寒冷暴露大鼠骨骼肌功能有很好的保护作用。

JKA97诱导HepG2凋亡及其分子机制研究

目的:研究药物JKA97对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用及其分子机制。方法:采用MTT法观察药物JKA97对细胞增殖的影响;倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot方法检测线粒体融合蛋白mfn2表达水平变化。结果:药物JKA97抑制人肝癌细胞HepG2细胞增殖,5、10、20μmol/L作用组24h抑制率分别为34.26%、43.08%、54.02%;药物JKA97诱导人肝癌细胞HepG2凋亡,10、20μmol/LJKA97作用HepG2细胞24h,细胞凋亡率分别为22.9%、72.9%;线粒体融合蛋白mfn2表达水平显著降低。结论:药物JKA97对人肝癌细胞HepG2生长具有明显的增殖抑制作用,诱导细胞凋亡;线粒体融合蛋白mfn2表达水平降低可能是其重要的分子机制之一。