大鼠肺成纤维细胞原代分离培养方法优化

目的:探索大鼠肺成纤维细胞(PFs)快速分离培养方法,为肺纤维化体外研究提供更为科学便利的技术支持。方法:取新生SD大鼠肺组织,采用Ⅱ型胶原酶/胰酶混合酶消化法,应用显微镜对每次组织消化细胞悬液及沉淀进行观察分析,选择性收集细胞悬液,同时对细胞差速贴壁时间进行梯度分组,优化最佳细胞贴壁时间节点,应用考马斯亮蓝染色观察细胞形态的均一性,应用波形蛋白标记鉴定PFs的纯度,应用α-平滑肌肌动蛋白标记鉴定细胞的分化能力,绘制细胞生长曲线检测细胞生长活性。结果:新生SD大鼠肺组织经前2次8 min消化,细胞悬液中主要为血细胞成分,沉淀多为血凝块和实质性组织成分;第3~6次消化后的细胞悬液主要为有核细胞成分,消化液沉淀多为胶原、黏连蛋白等基质团块。选择第3~6次消化细胞悬液进行差速贴壁分离细胞,综合细胞数量和细胞纯度分析,35 min差速贴壁最为理想,细胞活性较好,第1~4代细胞24 h达到对数生长期。结论:采用分次酶消化组织,有目的性地选取细胞悬液,35 min差速贴壁分离PFs,培养效果较好。