人UbcH10及其siRNA真核表达载体的构建与表达

目的:构建以人泛素结合酶UbcH10基因为基础的真核表达质粒pcDNA3.1(UbcH10)及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo(siRNA-UbcH10),并在结肠癌细胞LOVO中表达与鉴定。方法:提取组织总RNA,通过RT-PCR扩增出UbcH10基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点中,构建UbcH10的真核表达载体。通过siRNA设计软件选取UbcH10基因的siRNA片段合成构建表达载体pGPU6/GFP/Neo(siRNA-UbcH10)。然后采用脂质体转染法将其分别转染LOVO细胞,用RT-PCR在RNA水平和Western Blot在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。结果:测序结果显示克隆UbcH10基因片段序列完全正确;重组质粒转染LO-VO细胞后,检测到pcDNA3.1(UbcH10)转染组UbcH10表达增强,而pGPU6/GFP/Neo(siRNA-UbcH10)转染组UbcH10表达减弱。结论:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(UbcH10)及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo(siRNA-UbcH10),并在真核细胞中能有效表达,为今后进一步研究UbcH10的功能和作用机制奠定了基础。

泛素结合酶-10表达对结直肠癌细胞增殖的影响

目的探讨泛素结合酶-10(Ubiquitin-conjugating enzymes,UbcH10)表达对结直肠癌细胞增殖的影响。方法采用脂质体LipofectamineTM2000转染人UbcH10的真核表达载体pcDNA3.1-UbcH10及其对照载体pcDNA3.1至结直肠癌细胞LoVo,蛋白印迹(Western blot)技术分析UbcH10的表达;细胞增殖试验(CCK-8试剂)检测UbcH10表达对LoVo细胞增殖的影响;流式细胞术检测UbcH10表达对LoVo细胞周期的影响。结果 Westernblot分析证实,与对照组细胞相比,转染重组质粒的LoVo细胞中UbcH10表达明显升高;细胞生长增殖曲线显示,UbcH10过度表达的细胞生长明显快于对照组细胞。流式细胞术分析细胞周期结果显示:与对照组相比,UbcH10过度表达组细胞在G2-M期分布明显减少(P<0.05)。结论 UbcH10能促进结直肠癌细胞增殖,调控细胞周期进展可能是其潜在的作用机制。