一株猪CD56单克隆抗体的制备及抗原表位的初步鉴定

CD56作为NK细胞的重要表面分子,在NK细胞的发育、亚群分型和功能发挥等方面发挥重要的作用。因此,为了便于筛选不同亚群的猪NK细胞并探究其生物学功能,本研究制备了猪CD56单克隆抗体并对其抗原表位进行了初步鉴定。首先,通过生物信息软件预测并选取猪CD56蛋白胞外区的优势抗原表位的氨基酸序列(50-499aa),利用原核表达系统表达猪CD56胞外区的优势抗原表位蛋白并进行纯化和复性,之后,将猪CD56重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、亚克隆等试验,获得一株稳定分泌猪CD56单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1G8。Western blot结果显示,制备的猪CD56单抗可以与猪脑和脾总蛋白发生特异性结合;为了进一步验证CD56单抗的特异性,作者分离了猪外周血NK细胞,以制备的猪CD56单抗作为一抗进行间接免疫荧光试验,结果显示,制备的单抗能够与NK细胞膜特异性结合。最后,为了进一步探究单抗识别的抗原表位,作者将选取的猪CD56基因进一步截短为四个截短体(50-192 aa、193-294 aa、295-397 aa、398-499 aa)并构建真核表达重组质粒,然后转染至293T细胞进行真核表达,Western blot和间接免疫荧光结果显示,制备的CD56单抗识别的抗原表位为猪CD56蛋白的193-294 aa。综上,本研究成功制备了猪CD56单克隆抗体,并对其特异性及抗原表位进行了初步鉴定,对猪NK细胞亚群的筛选及探究猪NK细胞的生物学功能具有重要意义。

线粒体自噬在神经退行性疾病中调控的研究进展

神经退行性疾病是一种以神经元发生进行性变性和坏死为基础的中枢神经系性疾病,其普遍特征是错误折叠蛋白质的积累和线粒体损伤。线粒体作为细胞能量产出的中心,是神经元的主要能量来源,对维持神经元的结构和功能至关重要。受损的线粒体导致细胞中的三磷酸腺苷(ATP)供给不足和氧化应激损伤,甚至引起细胞死亡。线粒体自噬是细胞通过自噬-溶酶体途径选择性地清除衰老或受损线粒体的过程,是线粒体质量控制机制的重要组成部分,在维持细胞稳态方面发挥重要的作用。诸多研究表明,线粒体自噬与神经退行性疾病的发生和发展密不可分,激活线粒体自噬或改善线粒体自噬异常能在一定程度上缓解错误折叠蛋白积聚导致的神经损伤。笔者就线粒体自噬的发生机制、线粒体自噬的调控及其在神经退行性疾病发生发展中的作用进行综述,以期为神经退行性疾病的研究和治疗提供参考。

GRP78在伪狂犬病病毒感染过程中的作用研究

为探究热休克蛋白70家族成员葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在伪狂犬病病毒(PRV)感染宿主过程中的作用,本研究利用PRV Min-A株感染PK-15细胞后,采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测GRP78蛋白的表达和亚细胞定位情况,western blot结果显示,与对照组相比,PRV感染组的GRP78蛋白水平未见明显变化;IFA结果显示,PRV感染组细胞膜上GRP78的荧光强度明显增加。进一步通过生物素标记细胞膜蛋白,然后利用磁珠分离细胞膜蛋白,经western blot检测结果显示,PRV感染组细胞膜中GRP78的蛋白水平显著高于未感染PRV的对照组(P<0.05)。可见PRV感染不影响细胞内GRP78蛋白的表达,但能够增加GRP78在细胞膜中的含量。利用GRP78多克隆抗体(pAb)与PK-15细胞共孵育1 h后感染PRV,经空斑试验检测细胞上清中的病毒滴度,结果显示,与对照组相比,GRP78 p Ab孵育组的病毒滴度未见明显变化,表明GRP78并不是PRV侵入宿主细胞的关键因子。通过IFA检测GRP78与PRV在细胞中的共定位情况,结果显示,GRP78与PRV在细胞膜上无共定位,但二者在细胞质中有共定位。分别在PK-15细胞中下调或者过表达GRP78后感染PRV,采用western blot和空斑试验分别检测细胞内PRV的蛋白合成和细胞上清中的病毒滴度,结果显示,GRP78下调后PRV蛋白和病毒滴度显著低于对照组(P<0.05),而过表达GRP78组的病毒滴度明显高于对照组,表明GRP78参与调节PRV的释放。本研究首次表明GRP78作为一种重要的宿主因子参与调节PRV从宿主细胞内的释放,该结果为进一步研究PRV与宿主细胞的相互作用提供了参考依据。

猪伪狂犬病病毒SX-2018变异株的分离鉴定及其致病性研究

本研究从疑似暴发伪狂犬病(pseudorabies,PR)猪场死亡的仔猪中分离到1株病毒,经组织病理学剖检、PCR试验、Western-blot分析,将其鉴定为伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),遂被命名为SX-2018,该病毒在MDCK细胞上具有较强的适应性。将SX-2018株gE基因的序列与国内外21株PRV参考序列进行同源性比较,结果显示,SX-2018株gE基因与国内外参考毒株的核苷酸序列同源性为97.1%~99.9%,氨基酸同源性为94.5%~100%。遗传进化分析显示,SX-2012株与我国近几年新分离的猪伪狂犬变异毒株处于同一分支;并且与经典株相比,gE蛋白在第48位和第492位各有1个天冬氨酸的插入。为了进一步探讨SX-2018毒株的致病性,将SX-2018株和Min-A株分别感染BALB/c小鼠,分析两组小鼠的发病特征和组织损伤情况;结果显示,SX-2018组的小鼠死亡时间早于Min-A组;并且Min-A组小鼠的肺脏主要表现为间质性肺炎,而SX-2018组的小鼠以出血性肺炎为主。荧光定量PCR分别检测两组小鼠肺脏内PRV gI基因和炎症相关因子的变化;结果显示,SX-2018组小鼠肺组织内的gI基因以及炎症相关因子的mRNA水平显著地高于Min-A组小鼠。以上结果表明,本文成功分离到1株PRV变异毒株,并且与PRV经典株Min-A株相比,新分离的变异毒株可以诱导不同程度的病理损伤和炎症反应。