玉米赤霉烯酮对体外培养鸡脾脏淋巴细胞凋亡的影响

本试验旨在研究玉米赤霉烯酮(ZEA)对体外培养鸡脾脏淋巴细胞凋亡的影响。选用40~60日龄健康的伊莎公鸡,无菌条件下取脾脏,制备淋巴细胞悬液。ZEA染毒浓度为0(对照)、0.10、0.40、1.60、6.25和25.00μg/m L,染毒48 h后检测体外培养鸡脾脏淋巴细胞凋亡率、坏死率、细胞线粒体膜电位、细胞内活性氧(ROS)含量以及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bak-1、p53及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达量及细胞培养液上清中上述相应凋亡基因蛋白含量。结果显示:与对照组比较,ZEA染毒导致鸡脾脏淋巴凋亡率、坏死率、ROS含量、细胞培养上清液中p53、Bax、Bak-1及caspase-3的含量以及细胞内p53、Bax、Bak-1及caspase-3的mRNA表达量显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01),且随毒素浓度升高而升高;而ZEA组细胞线粒体膜电位和上清液Bcl-2含量却极显著低于对照组(P<0.01)。由此可知,ZEA染毒可促进体外培养鸡脾脏淋巴细胞凋亡,且呈剂量依赖性。

重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法及免疫原性研究

[目的]探索重组布鲁菌Omp19蛋白的制备方法,评价其在实验动物中的免疫原性,为中试工艺放大奠定基础。[方法]利用摇瓶培养对重组Omp19蛋白进行原核诱导表达,对培养基类型、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间、诱导时的菌体密度等条件进行筛选;利用阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析对重组Omp19蛋白进行纯化制备;利用SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)对重组Omp19蛋白的纯度进行鉴定;利用动物实验评价制备的重组Omp19蛋白的免疫原性。[结果]摇瓶培养试验表明,重组布鲁菌Omp19蛋白较优的表达条件为:使用LB培养基,在菌密度OD600 nm值为0.6~1.0时加入0.5 mmol/L的IPTG,于28℃诱导5 h;经3步纯化后,获得了高纯度的重组Omp19蛋白;免疫原性研究表明,经方法优化后制备的重组Omp19蛋白联合佐剂可以较好地刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体。[结论]优化了重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法,评价了其在小鼠中的免疫原性,为重组布鲁菌疫苗的研发提供了实验基础。

DON、ZEA联合染毒对体外培养鸡脾脏淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影响

旨在研究DON、ZEA联合染毒对体外培养鸡脾脏淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影响。DON、ZEA联合染毒剂量为0.012 5μg·mL^(-1)和0.006 25μg·mL^(-1)、0.050μg·mL^(-1)和0.025μg·mL^(-1)、0.2μg·mL^(-1)和0.1μg·mL^(-1)、0.8μg·mL^(-1)和0.4μg·mL^(-1),进行DON、ZEA联合染毒48 h对鸡脾脏淋巴细胞上清液IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量及其mRNA表达的影响。结果表明,各染毒组细胞上清液IL-10和IFN-γ蛋白含量,细胞内IL-2、IL-4和IL-10 mRNA水平随毒素剂量的升高而增加(P<0.01);各染毒组细胞上清液IL-2和IL-4蛋白含量均随毒素浓度的升高而降低(P<0.01);细胞内IFN-γmRNA表达量均随毒素浓度的升高而先升高后降低(P<0.01)。DON、ZEA联合染毒导致细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ分泌失衡,且呈剂量依赖性;DON、ZEA联合染毒鸡脾淋巴细胞上调或下降促炎性细胞因子的水平;Th1和Th2细胞因子平衡失调,因此造成细胞免疫损伤,从而对细胞产生毒性。

炭疽芽孢杆菌新抗原NlpC的重组表达与免疫评价

目的:构建炭疽芽孢杆菌新抗原NlpC的原核表达质粒,制备NlpC重组蛋白并进行免疫评价,为新型炭疽亚单位疫苗研发提供参考。方法:运用生物信息学软件分析和预测NlpC蛋白的跨膜区、信号肽、疏水性、保守性等性质;PCR扩增nlpc基因片段,构建NlpC原核表达质粒,IPTG诱导表达,His亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE与Western印迹鉴定纯化的蛋白;NlpC重组蛋白联合佐剂免疫小鼠后,ELISA法检测免疫血清的抗体效价,体外实验检测免疫血清抑制芽孢萌发功能,BALB/c小鼠免疫攻毒实验评价免疫保护效果。结果:生物信息学分析结果表明NlpC有信号肽,无跨膜区,亲水性好,具有较高的保守性;构建了NlpC原核表达质粒,经诱导表达与纯化获得了纯度高于95%的NlpC蛋白;免疫评价结果显示NlpC联合Al(OH)3+CpG佐剂可激发小鼠产生高水平的抗体反应,NlpC免疫血清可在体外抑制炭疽芽孢萌发,NlpC免疫组可显著延长炭疽杆菌芽孢攻毒后小鼠存活时间。结论:NlpC具有较好的免疫原性,是潜在的炭疽杆菌保护性抗原,可作为新型炭疽亚单位疫苗的候选组分。