桑树Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(MnNHX1)的克隆与耐盐力表达

【目的】研究川桑液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)基因的功能,探究桑树耐盐机制,为植物抗逆基因工程筛选提供优良的候选基因。【方法】以川桑基因组数据库为基础,基于同源基因序列的保守性,以川桑叶片cDNA为模板克隆川桑液泡膜型NHX基因;利用生物学软件和在线公共平台,分析所得基因编码的蛋白质序列及功能结构域,并构建系统进化树,分析与其他物种的亲缘关系。采用荧光定量PCR方法研究在NaCl胁迫条件下不同时间段‘湖桑32号’根、茎、叶等不同组织中桑树NHX1表达量的变化情况;通过构建超量表达载体,将其转化到拟南芥中,分析转基因拟南芥在Na Cl胁迫环境中的种子发芽数,根长、侧根生长情况和幼苗成活率,并对转基因拟南芥连续浇灌含高浓度Na Cl的营养液,研究过量表达NHX基因对拟南芥的影响。【结果】本研究得到1个液泡膜型NHX基因,命名为MnNHX1(Gen Bank登录号:KJ720637);该基因ORF长度为1 644bp,编码547个氨基酸残基,具有Na+/H+交换泵,且在其上游含有抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点(LFFIYLLPPI)以及糖基化位点等结构域,TMHMM在线程序预测Mn NHX1具有12个明显的跨膜结构区;系统进化树分析结果显示,Mn NHX1具有较高的保守性,先与源于蔷薇科的桃聚合,与桑树形态学和基因组进化分析分类结果一致。荧光定量PCR试验表明,在无Na Cl胁迫条件下桑树NHX1在‘湖桑32号’根、茎、叶中均有表达;在Na Cl胁迫处理12 h后,根、茎中桑树NHX1的表达量显著增加,而后回落;而在胁迫处理24 h后,叶中桑树NHX1的表达量显著提高,随后回落。过量表达Mn NHX1的转基因拟南芥在Na Cl胁迫环境中,种子发芽率低于野生型,而根长和侧根生长情况以及幼苗成活率都优于野生型;连续浇灌含高浓度Na Cl营养液的转基因拟南芥生长状态更为优良。【结论】MnNHX1为优良的植物耐盐基因,在桑树中为组成型表达,并受Na Cl胁迫诱导,表现出组织特异性。过量表达Mn NHX1的拟南芥耐盐能力显著提高,生存在盐胁迫环境中,依然具有良好的生长和发育能力。

盐胁迫下不同桑品种种子萌发特性研究

设置7个NaCl质量浓度梯度(0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%)对粤桑69851、沙2×伦109、河南实生桑、桂优62四个桑品种种子进行NaCl胁迫处理,测定不同品种在不同处理下的发芽率、发芽势、发芽指数、盐害指数及胚根、胚芽长等指标,以研究NaCl胁迫对不同桑品种种子萌发特性的影响。结果表明,NaCl胁迫对不同桑种种子的萌发有相似的作用模式。低浓度的NaCl溶液(小于0.4%)可促进沙×伦109、河南实生桑、桂优62种子的萌发,当NaCl溶液浓度高于0.4%时则变为抑制作用。综合各项指标分析表明桂优62的耐盐性最强,其次为沙×伦109,再次为粤桑69851,河南实生桑的耐盐性最差。

中华根瘤菌NP1亚硝酸盐还原酶基因的表达和酶学性质研究

[目的]研究中华根瘤菌NP1(Sinorhizobium sp.NP1)中亚硝酸盐还原酶基因(nir)的原核表达情况以及粗酶液的化学性质。[方法]构建该基因的原核表达载体p ET32a-nir,然后对重组蛋白质进行SDS-PAGE和Western blotting分析获得NIR酶在原核生物中的表达情况。通过测定粗酶液对亚硝酸盐降解情况研究相关酶学性质。[结果]SDS-PAGE检测结果表明,可溶性融合表达产物约为57 ku,其中亚硝酸盐还原酶大小约40 ku,与酶分子量的预估值一致;Western blotting证实该蛋白可与根据亚硝酸盐还原酶合成的多克隆抗体发生强阳性反应;酶学性质分析表明,亚硝酸盐还原酶活力约为247.15 U/m L,最适pH 6.5,最适反应温度37℃,该酶对Na Cl的耐受性为0.3 mol/L。[结论]亚硝酸盐还原酶蛋白重组质粒能在大肠杆菌系统中高效表达,研究其酶学性质为NO_2^-生物清除提供了技术保障。

一株咔唑降解菌的鉴定及其降解特性研究

从青海油井口污泥中,分离出一株能高效降解咔唑的细菌B1。采用富集培养法筛选降解菌株,并利用生理生化特征及16S r DNA基因序列分析鉴定菌株种类,利用高效液相色谱法测定培养液中咔唑浓度。研究菌株在不同p H、盐浓度、温度等条件下的降解能力,及外加碳源、氮源和底物浓度对降解效率的影响。经鉴定,菌株B1属于Sphingosinicella sp.。最适温度和p H分别为30℃和7.0,最适条件下菌株B1在72 h内对100mg/L咔唑的降解率可达到98%,同时该菌株在盐浓度小于10 g/L时降解率较高。此外,研究结果显示,添加0.1 g/L的葡萄糖和硫酸铵能明显提高其降解效率,且菌株B1能耐受700 mg/L浓度的咔唑。研究表明,菌株B1具有高效降解咔唑的能力及良好的环境适应性。

鞘氨醇胞菌B1咔唑降解基因carB的克隆与功能研究

以分离到的咔唑高效降解菌鞘氨醇胞菌B1为材料,研究该菌株咔唑降解基因簇的组成和表达模式,阐释咔唑降解过程中关键酶的作用机理。通过分析不同菌株咔唑降解基因簇中基因的保守区,从菌株B1中成功克隆得到基因簇中car Aa、car Ba、car Bb和car C基因片段。通过RT-PCR证实菌株B1的咔唑降解基因簇为诱导表达。通过同源克隆得到降解关键基因car B和编码两个亚基的car Ba、car Bb基因,并在大肠杆菌中进行了异源表达。以2,3-二羟基联苯为底物,对Car B粗酶液进行了酶学性质分析。研究表明Car B蛋白催化最适p H和温度分别为7.4和30℃,Fe2+能显著提高酶的催化活力。