CAR－bacillus亚单位rRNA基因分子克隆及斑点杂交方法的建立

用真细菌类亚单位ｒＲＮＡ中的保守序列片段合成引物，从小鼠来源的ＣＡＲ－ｂａｃｉｌｌｕｓＣＢＭ株的基因组中用ＰＣＲ方法扩增出其１．５ｋｂ大小的基因片段，两端加尾ｄＣ，和已加尾ｄＧ的ｐＢＲ３２２质粒连接，转化入ＪＭ１０９菌中，在含有四环素的培养基中挑选克隆经氨苄青霉素筛选后，在ＬＢ基液中大量增殖，经溶茵酶裂解，提取重组质粒；经ｐｓｔⅠ消化，得到１．５ｋｂ大小的插入片段，经ＨｉｎｄⅢ、ＨｉｎｆⅠ、ＥｃｏＴ１４、ＨｅａⅢ和ＸｈｏⅠ测定忠实性后，以此为模板，用非放射地高辛标记试剂盒合成探针，其灵敏性可达１．２ｐｇ，且特异性较强。

SCID小鼠中牛瑟氏泰勒焦虫主要抗原蛋白编码基因酶谱分型

提取ＳＣＩＤ小鼠血中被转移入的牛红细胞中瑟氏泰勒焦虫的组ＤＮＡ，利用已知其主要表面抗原３２ｋ蛋白编码基因的５＇和３＇附近序列合成引物，经ＰＣＲ方法扩增出其约９００ｂｐ的基因片段，用胶纯化后两端加尾ｄＣ，和已加尾ｄＧ的ｐＢＲ３２２质粒连接，转化入大肠杆菌ＪＭ１０９中，经含有四环素的培养基中挑选２０～３０个克隆后再经氨苄青霉素筛选出理想克隆２０～３０个，在４ｍｌＬＢ基液中增殖，经溶菌酶裂解，提取重组质粒，再用相同引物提取每个克隆中的基因片段，经ＨｉｎｄⅡ，ＢｇｌⅠ和ＫｐｎⅠ内切酶切割，电泳后依其酶谱，主要可分出两种图型，提示自然感染牛红细胞的瑟氏泰勒焦虫主要抗原蛋白编码基因有差异，为制备疫苗奠定了基础。