化疗联合G-CSF动员的骨髓及外周血CD34^+细胞表达粘附分子的变化

探讨化疗联合G CSF动员前、后患者骨髓及外周血CD34+细胞表达CD4 4 ,CD4 9d ,CD6 2L及趋化因子CXCR4的动态变化 ,用免疫荧光直接三色标记和流式细胞术测定G CSF动员前、后骨髓及外周血CD34+细胞的CD4 4 ,CD4 9d ,CD6 2L及趋化因子CXCR4的表达 ,观察输注各表达亚群细胞数与移植后造血重建的关系。结果发现 ,动员后骨髓中CD34+CD4 4 +和CD34+CD4 9d+细胞的百分比较动员前明显降低 ,而外周血中二者的比例则显著升高 ;动员前、后骨髓中CD34+CD6 2L+和CD34+CXCR4 +细胞的变化并不明显 ,而外周血中前者明显增加 ,后者则显著减少。输入CD4 4 +,CD4 9d+,CD6 2L+及CXCR4 +的CD34+细胞的量与移植后血中中性粒细胞和血小板恢复的时间未表明有显著的相关。结论 :G CSF动员可下调骨髓CD34+细胞的CD4 4 ,CD4 9d ,CD6 2L及CXCR4的表达 ,从而进入外周血循环 ,输注这些细胞的临床意义有待累积更多病例的分析。

基因枪转染IgHV1-GM-CSF基因在树突细胞中的表达

目的探讨基因枪颗粒轰击转染人树突细胞(DC)的方法,以及基因枪转染基因疫苗质粒IgHV1-GM-CSF/pcDNA3.0在DC中的表达。方法利用Ficoll密度梯度法分离人外周血单个核细胞(PBMC),贴壁方法获取单核细胞作为DC前体,在重组GM-CSF和IL-4的支持下诱导培养为用于转染的未成熟DC(i mDC);制备人免疫球蛋白重链基因可变区家族的框架区基因疫苗质粒和增强绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)。设定不同的转染条件,采用基因枪方法将pEGFP质粒转染入DC,荧光显微镜下分别计数绿色荧光阳性细胞数和细胞总数,计算转染率;台盼蓝染色计数活细胞,计算细胞存活率;比较基因枪、脂质体及电转染3种方法的转染效率。以基因枪方法在最佳条件下将IgHV1-GM-CSF/pcDNA3.0及pEGFP质粒共转染DC,提取细胞RNA,RT-PCR方法检测IgHV1-GM-CSF的表达,ELISA方法检测GM-CSF的表达。结果选择基因枪转染的优化条件为:转染压力120psi、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浓度0.02mg/ml、微载体负载量(MLQ)0.5mg金/子弹、DNA负载率(DLR)1.5μg质粒DNA/子弹。基因枪转染的效率为10.5%±2.4%(n=3),电转染方法为45.2%±5.6%(n=3),而脂质体方法只有个别DC表达荧光蛋白,三者比较差异有统计学意义(P<0.01)。基因枪方法转染的DC能够保持其特殊细胞形态,细胞表面标志在转染中无明显变化,而电转染后细胞大量死亡。应用基因枪转染方法,基因疫苗质粒IgHV1-GM-CSF/pcDNA3.0在DC中得到瞬时表达。结论基因枪颗粒轰击可使基因疫苗在DC中成功表达,是临床细胞免疫治疗中DC转染的一种可行选择。

骨髓增生异常综合征中CD34^+细胞CXCR4的表达及其与细胞迁移的相关性

目的:探讨不同危险度骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsymdromes,MDS)中骨髓CD34+细胞CXCR4的表达情况及其与细胞迁移率的相关性。方法:收集40例骨髓增生异常综合征患者的骨髓标本,根据IPSS积分系统进行危险度分组。低危组20例:IPSS积分0~1.5分;高危组20例:IPSS积分≥1.5分;同时采集10例健康者的骨髓标本作为对照。分离纯化骨髓CD34+细胞,通过流式细胞术检测CXCR4膜蛋白的表达;研究SDF-1α趋化作用下CD34+细胞的迁移率及CD34+细胞对骨髓基质细胞的迁移率。结果:高危组MDS患者CD34+细胞CXCR4的表达率明显高于低危组和正常对照组(P<0.000 1);低危组和正常对照组之间CXCR4的表达率无显著性差异(P>0.05)。高危组CD34+细胞对SDF-1α及骨髓基质细胞的迁移率显著高于低危组及正常组(均P<0.000 1),且其对骨髓基质细胞的迁移率与CXCR4的表达呈正相关(P=0.000 1)。结论:高危组MDS患者CD34+细胞CXCR4的表达量及其对骨髓基质细胞的迁移率均明显高于低危组患者,且其迁移率随CXCR4表达量的增加而升高,不同风险组的MDS患者存在SDF-1及其受体CXCR4表达和功能上的差异,SDF-1及其受体CXCR4在MDS发病中具有重要作用。

骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞SDF-1基因的表达

本研究探讨骨髓基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达水平。采集MDS的骨髓标本,分离、培养和扩增MSC,观察细胞形态并进行表型鉴定;以实时定量RT-PCR法检测间充质干细胞SDF-1基因和内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达水平,并与健康供者的表达水平相比较。结果发现,MDS患者骨髓间充质干细胞SDF-1基因的表达水平经GAPDH校正后为1.53±0.92,与对照组(5.51±0.99)相比差异非常显著(P<0.01)。结论:SDF-1基因在MDS患者骨髓间充质干细胞中的表达显著升高,SDF-1基因的异常表达可能影响MDS患者骨髓微环境的造血调控作用,是否可对MDS的发病机制及治疗提供新的思路值得进一步探讨。

特异性增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ表达mIFN-γ及体外肿瘤杀伤实验

目的:构建增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ和增殖缺陷型腺病毒AdEasy—mIFN-γ,比较两者在肿瘤细胞中表达mIFN-γ蛋白的能力以及CNHK200-mIFN-γ,ONYX-015及野生型腺病毒Ad5在正常及肿瘤细胞中的增殖力,进一步观察其抗瘤效果。方法:以病毒增殖试验检测病毒在细胞中的增殖能力;透射电镜观察CNHK200-mIFN-γ在Hep3B细胞中的增殖复制;检测病毒感染肿瘤细胞后mIFN-γ的表达;CPE实验观察增殖病毒对细胞的杀伤效应。结果:CNHK200-mIFN-γ和ONYX-015仅在肿瘤细胞中增殖,且前者增殖力较强。CNHK200-mIFN-γ在肿瘤细胞中表达mIFN-γ,且表达量与病毒增殖密切相关,而AdEasy—mIFN-γ在肿瘤细胞中的mIFN-γ表达几乎不能测到。ONYX-015与CNHK200-mIEN-γ对正常的细胞无杀伤性,但能有效地杀伤癌细胞。结论:外源基因mIFN-γ的插入没有改变增殖病毒在肿瘤细胞中选择性增殖的特性。增殖型腺病毒CNHK200-mIFN-γ具有良好的肿瘤选择性及增殖性,且可以有效表达mIFN-γ,并且有效杀伤癌细胞,显示其良好的临床应用前景。

多发性骨髓瘤黏附分子CD11a、CD49d的表达特点及临床意义

目的:研究多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓单个核细胞黏附分子CD11a、CD49d的表达,并探讨其发病机制。方法:用流式细胞仪检测CD11a、CD49d在MM组及对照组2组骨髓标本单个核细胞表达的平均荧光强度和荧光阳性细胞百分率。结果:MM患者骨髓单个核细胞CD49d的表达荧光强度较对照组增强(P<0.05);CD11a的表达阳性细胞百分率及荧光强度均较对照组增强(P<0.05,P<0.01);进展期表达较平台期明显增强(P<0.05,P<0.01)。结论:MM单个核细胞表面CD49d的表达增强,导致患者骨髓细胞与细胞及细胞与骨髓基质间的黏附异常,可能参与了MM的病理过程,而CD11a在MM的平稳期表达较低,进展期表达明显增强,表明CD11a在MM增殖中起作用。

rhG-CSF动员对异基因造血干细胞移植供者外周血CD4^+ T细胞S1P_1表达的影响

CD4+ T细胞主要通过其表面的S1P1受体与外界的第一信使1磷酸鞘氨醇(S1P)相互作用调节免疫功能。本研究旨在探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员对异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)供者外周血CD4+ T细胞S1P1表达的影响。17例allo-HSCT供者于rhG-CSF动员前及动员后第4天采集外周血,使用磁珠分选法纯化CD4+ T细胞,提取微量RNA,用实时定量PCR法检测S1P1的表达。结果显示,rhG-CSF动员前后CD4+ T细胞均表达S1P1,且动员后S1P1在CD4+ T细胞中的表达明显低于动员前。结论:rhG-CSF动员使allo-HSCT供者外周血CD4+ T细胞S1P1的表达明显下调。

健康人外周血KIR表达规律分析

本研究旨在分析杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)在健康人的基因型及表达谱,探索KIR受体在健康人的表达调控规律。采用PCR及RT-PCR技术检测健康人NK-92MI及Molt4细胞系中KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DL1、3DL2、3DL3、3DS1、2DP1、3DP1的基因型及KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS3及KIR2DS2/4受体mRNA的表达。结果表明,KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3和KIR3DP1在所有受试者、NK-92MI及Molt4细胞中均能检测到基因型。NK-92MI表达KIR2DL1、KIR2DL3及KIR2DS2/4,Molt4不表达KIR。比对健康人的基因型及mRNA表现型发现,若健康人能检测到KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DS1、2DS2、2DS3和2DS4的基因型,其外周血几乎均有相应的KIR的mRNA表达,但KIR各基因的表达强度不同。结论:KIR各基因在健康人的表达水平不同,同一个体中各基因的表达量不一致,同一KIR基因在不同个体内的表达水平也不一致。

急性非淋巴细胞性白血病细胞共刺激分子的表达

目的 :检测急性非淋巴细胞白血病患者白血病细胞表面MHC -Ⅱ类分子和共刺激分子的表达情况。方法 :采集骨髓中白血病细胞大于 70 %的 2 7例初诊或复发患者骨髓细胞 ,荧光抗体标记 ,应用流式细胞仪进行HLA -DR、CD80 (B7- 1)和CD86(B7- 2 )免疫标记检测。结果 :2 7例病人除M3型表达明显低于其他各型外 ,HLA -DR抗原的表达均较高 ,其中M2型最高为90 % ;CD80阳性率很低 ,最高为M1型只有 5 % ,其余均在 1%～ 3%之间 ,CD86的表达高于CD80 ,最高为M5型为 4 8% ,最低为M6型为 11%。结论 :白血病细胞表面共刺激分子表达以CD80缺乏为主。

IL2、IL15对NK细胞KIR3DL1、NKG2D表达的影响

目的研究细胞因子IL-2、IL-15对人外周血来源的自然杀伤细胞(Nature Killer,NK)细胞表面功能相关分子杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Cell Immnoglobulin-like Receptor,KIR3DL1)、NKG2D表达的影响。方法采用miniMACS免疫磁珠从外周血单个核细胞(PBMNC)分选得到纯化的NK细胞,在IL2、IL15作用下培养15d,检测培养前后在不同效靶比下对靶细胞(K562)的杀伤作用变化,之后流式细胞仪检测培养前后NK细胞KIR3DL1、NKG2D表达变化;结果经IL2、IL15培养15d后的NK细胞对K562细胞的杀伤率在不同效靶比下均较培养前增强(P<0.01);同时NK细胞KIR3DL1表达下降约10%(P<0.05),NKG2D在培养前后均高表达(99%);结论经IL2和IL15长期体外培养后,KIR3DL1表达轻微下调,是NK细胞杀伤功能增强的原因之一。

Tet-off调控bcr/abl基因表达的细胞系293pT2-P210的建立

慢性髓系白血病(CML)是一种以髓系细胞受累为主的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为:位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因,并编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210bcr/abl融合蛋白,该蛋白通过多种信号通路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。本研究为构建能由Tet-off诱导表达系统调控bcr/abl融合基因表达的细胞系,为深入研究bcr/abl融合基因功能及其调控机制提供一种有价值的细胞模型。将bcr/abl融合基因亚克隆到pTRE2hyg载体构建重组质粒pT2-P210,同时将Tet-off质粒转染293细胞并筛选出单克隆,然后进一步转染pTRE2hyg-LUC质粒,通过荧光素酶活性检测选出能有效诱导目的基因表达的293Tet-off细胞,然后将重组质粒pT2-P210转染到293Tet-off细胞中。结果表明:筛选出了bcr/abl融合基因能被强力霉素有效调控的293pT2-P210单克隆细胞。结论:本研究筛选的293pT2-P210细胞为bcr/abl基因表达能被Tet-off诱导表达系统调控的细胞系,它们适用于bcr/abl融合基因功能及其信号调控机制的深入研究。

KIR在NK-92MI及K562细胞中的基因型及表达谱分析

目的:分析杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)在NK-92MI及K562细胞中的基因型及表达谱,探索KIR受体的表达调控规律。方法:采用PCR、RT-PCR及分子克隆测序技术,检测K562及NK-92MI细胞中KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DL1、3DL2、3DL3、3DS1、2DP1、3DP1的基因型,及KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS3及KIR2DS2/4受体mRNA的表达。结果:K562细胞携带KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5A、2DS2、2DS4*003-006、2DS5、3DL1、3DL2、3DL3基因,但不表达KIR。NK-92MI细胞携带KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DS2、2DS4*001/002、2DS4*003-006、3DL1、3DL2、3DL3,但只表达KIR2DL1、KIR2DL3及KIR2DS2/4。结论:K562细胞及NK-92MI细胞均携带KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DS2、2DS4*003-006、3DL1、3DL2、3DL3。NK-92MI细胞表达KIR受体,K562细胞不表达上述KIR,KIR呈细胞特异性表达。

慢性髓细胞白血病增殖细胞核抗原基因的异常表达

目的了解慢性髓细胞白血病(CML)基因表达谱规律,对在CML中高表达的PCNA基因进行分析鉴定。方法应用基因表达谱芯片技术,对CML患者和正常人的外周血单个核细胞(PBMC)基因表达差异进行分析。对于其中表达显著上调的增殖细胞核抗原(PCNA)基因,根据其核苷酸序列设计并合成该基因序列特异性引物,以CMLPBMC的总RNA为模板,RT-PCR技术扩增PCNA基因;用蛋白印迹法分析PCNA蛋白的表达。结果从4096个基因中筛选出差异表达基因共591条,其中288条基因表达增强,303条基因表达降低。在表达增高的基因中,PCNA表达增高8.725倍。在病人的标本中扩增出PC-NA基因,蛋白印迹证明CML病人PCNA蛋白表达增高。结论基因表达谱芯片检测发现CML中PCNA基因高表达,并在 mRNA转录水平及蛋白表达水平证明其异常表达,提示PCNA的表达增高与CML的发病存在一定的关系。

优势表达SphK-1基因对K562细胞生物学特性的影响

目的:了解优势表达鞘氨醇激酶-1(SphK-1)对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞生物学特性的影响。方法:使用pLXSN、pLXSN-SphK-1的重组逆转录病毒液感染K562细胞并用终浓度1 000 ng/m l的G418筛选感染pLXSN和pLXSN-SphK-1基因的K562细胞;取对数生长期的K562-pLXSN和K562-SphK细胞提取蛋白收集胞浆蛋白,应用BCA-200蛋白检测试剂盒进行蛋白定量。根据蛋白定量取蛋白含量相同的蛋白提取上清行γ3-2P-ATP掺入法检测K562-pLXSN和K562-SphK细胞SphK-1活性;并应用MTT法检测K562-pLXSN和K562-SphK细胞的增殖情况及对不同剂量格列卫的敏感性。结果:K562细胞转染SphK-1基因比转染空载体后的细胞SphK-1酶活性显著增高;K562-pLXSN细胞和K562-SphK细胞培养24 h、48和72 h后细胞增殖无显著性差异;当格列卫浓度为0.1和0.25μmol/L时,K562-PLXSN和K562-SphK细胞培养72 h后的细胞存活率无明显差异;当格列卫浓度为0.5至10μmol/L时,K562-SphK细胞存活率显著低于K562-PLXSN细胞(P<0.05)。结论:优势表达SphK-1基因对K562细胞自然增殖无显著影响,但增加了细胞对浓度高于0.5μmol/L格列卫的敏感性。

rhG-CSF动员对供者CD4^+T细胞表面分子表达的影响

目的了解重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在动员过程中对健康供者外周血CD4+T淋巴细胞比例和CD4+T细胞黏附分子、趋化因子受体和Tac抗原表达的影响。方法采用直接双色荧光标记和三色荧光标记通过流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞表面分子的表达。结果rhG-CSF动员前CD4+T细胞在外周血单个核细胞中比例的中位数为26.34%,动员后为25.24%,动员前后差异无统计学意义(P>0.05)。rhG-CSF动员使CD4+T细胞CD62L的表达率显著下降(P<0.01),动员前的表达率中位数为42.72%,动员后为4.82%。动员前后CD4+T细胞CD44和整合素LFA-1表达率均为100%;动员前VLA-4表达率的中位数为84.49%,动员后为85.66%;动员前细胞趋化因子受体CXCR-4表达率的中位数为84.78%,动员后为86.34%;动员前CD25表达率中位数为29.72%,动员后为26.24%,rhG-CSF动员对CD4+T细胞LFA-1、CD44、VLA-4、CXCR-4和CD25的表达率无显著影响(P>0.05)。结论rhG-CSF动员造成CD4+T细胞CD62L的表达率显著下降。

microRNA调控NK细胞KIR3DL1表达初探

目的初步探寻人外周血自然杀伤细胞(Nature Killer,NK)杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Cell Immnoglobulin-Like Receptor,KIR3DL1)表达可能存在的microRNA(miR)调控机制。方法利用生物信息学方法,从miR信息库中筛选出可能与KIR3DL1相关的miRs,构建含KIR3DL1 3’非翻译区(UTR)的PGL3质粒,分别将含相应miR的PcDNA3.0质粒与前者共转染293T细胞,通过荧光素酶报告实验及之后的突变实验筛选出可能调控KIR3DL1的miR。结果通过TARGET SCAN信息库筛选了miR-146b等10个miR;转染miR-146b后,荧光素酶活性下降最多(61.3%),突变其KIR3DL1 3’UTR靶位点后荧光素酶活性恢复(91.4%)。结论 miR-146b可与KIR3DL1’UTR在靶位点特异结合,很可能参与KIR3DL1表达的调控。

白血病细胞系WT1的表达及反义核苷酸对其的抑制作用

目的:探讨RT-PCR方法测定白血病细胞系WT1基因的表达以及WT1反义寡核苷酸对白血病细胞系增殖的抑制作用。方法:应用RT-PCR方法测定K562、HL-60、TF-1及U937 4株白血病细胞系WT1基因的表达,然后应用针对WT1翻译起始位点的反义寡核苷酸(WT1 ASO)处理K562细胞系、U937细胞系,采用锥虫蓝拒染法确定白血病细胞的增殖。结果:K562、HL-60及TF-1 3株白血病细胞系均高度表达WT1,而U937细胞系未测到WT1。WT1 ASO能够抑制WT1表达阳性的K562细胞的生长,对WT1表达阴性的U937则无抑制作用;而WT1有义寡核苷酸对K562细胞系、U937细胞系均无抑制作用。结论:RT-PCR测定方法可以检测WT1基因在白血病细胞系表达,WT1反义寡核苷酸对白血病细胞有特异的抑制作用。WT1基因在白血病细胞增殖过程中起一定作用。

强化治疗成人急性白血病41例的临床报告

强化治疗成人急性白血病４１例的临床报告７３００５０兰州兰州军区总医院达万明，王存邦，钟建庭，刘源，欧英贤，白海，吴晓雄，陆井之，徐淑芬强化治疗是近年来急性白血病临床疗效提高的重要因素之一［１］，然而临床观察及体外白血病细胞药敏试验证实，白血病细胞对抗...

异基因外周血造血干/祖细胞移植的进展

随着外周血造血干/祖细胞动员方案和采集技术的日益成熟,在20世纪最后10年中,异基因外周血造血干/祖细胞移植(allo-PBSCT)得到了迅速发展,据国际骨髓移植登记处(IBMTR)统计[1],1994年allo-PBSCT占全部异基因造血干细胞移植的2%,1998年则增至26%.

自体骨髓混合HLA半相合异基因骨髓移植治疗恶性血液病的临床研究

目的:观察混合BMT治疗恶性血液病的临床疗效,方法:用自体骨髓混合HLA半相合异基因骨髓移植,同时体外高热及液体培养净化联合IL-2激活骨髓细胞,移植后又注射IL-2,以提高体内对残留肿瘤细胞的净化效应,减弱GVHD反应和增强GVL效应,结果:①MBMT是安全的,16例中无1例发生急性GVHD,②近期疗效较好,移植后16例中5例复发,11例未复发,其中7例中位随访12月仍存活且CCR,余4例死于并发症和其它非血液病;③16例除1例因早期死于VOD外,余皆成功造血重建;④对6例供受者性别不同患者性染色体分析发现3例移植后形成嵌合体,最长者已15月余.结论:本研究为临床恶性血液病治疗可能提供了一个新的途径.